| | C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 5. Química de Macromoléculas | | ISOLAMENTO E PROPRIEDADES BIOQUÍMICAS DA LECTINA ISOLADA DAS SEMENTES DE
Coriandrum sativum | | | Jorgino Julio César 1 (autor) jorginoj@yahoo.com.br | | Bráulio Marcone de Castro 2 (autor) brauliomarcone@yahoo.com.br | | Alexandre Gonçalves Santos 1 (autor) alexandretimao@yahoo.com.br | | Marcelo Eurípedes de Oliveira 1 (autor) marceloeuripedes@bol.com.br | | Célio José de Castro Júnior 2 (colaborador) celiojcjunior@yahoo.com.br | | Marcos Aurélio de Santana 1 (colaborador) Marcosefar@yahoo.com.br | | Daniela Vieira Fernandes 3 (colaborador) danycng@yahool.com.br | | Milton Hércules Guerra de Andrade 4 (orientador) mguerra@nupeb.ufop.br |
| | 1. Farmacêutico, Mestrando em Ciências Biológicas - NUPEB, Inst. Ciênc. Exatas e Biológicas - UFOP | | 2. Graduando em Farmácia, Aluno Iniciação Científica - NUPEB, Inst. Ciênc. Exatas e Biológicas - UFOP | | 3. Bióloga, Mestranda em Ciências Biológicas - NUPEB, Inst. Ciênc. Exatas e Biológicas - UFOP | | 4. Prof. Dr. do Núcleo de Pesq. em Ciênc. Biológicas - NUPEB, Inst. Ciênc. Exatas e Biológicas - UFOP |
| | INTRODUÇÃO:
As lectinas são uma classe estruturalmente diversa de proteínas, com capacidade de se ligar reversivelmente em carboidratos com considerável especificidade. São ligantes de origem não-imune e oligoméricos. Geralmente são originárias de plantas, bactérias, etc.Devido as suas propriedades ligantes, possuem inúmeras atividades biológicas, tais como a habilidade de aglutinar eritrócitos, linfócitos, bactérias, e outras células.
Sendo, as lectinas moléculas tão particulares e prevalentes, podem esconder propriedades e aplicações a sistemas biológicos de valor inestimável. Motivos como este despertam grande interesse na sua pesquisa.
O Coriandrum sativum (Coentro) é uma planta da família Umbelliferae, anual, apresentando folhas semelhantes às da salsa e de aroma muito agradável sendo usada por isso como condimento.
Após a realização de um screening através da atividade hemaglutinante ABO utilizando extratos de semente de diversos tipos de flores, leguminosas, que são riquíssimas juntamente com os cereais em lectinas; dentre outras, chegamos ao coentro que apresentou certa especificidade para o tipo sangüíneo B.
Nosso trabalho teve como objetivo o isolamento da lectina de Coriandrum sativum e ainda encontrar aplicações biológicas para a mesma no que se refere à ligação a moléculas e outras estruturas biológicas que não somente eritrócitos. | | METODOLOGIA:
Obtenção do extrato aquoso: sementes de Coriandrum sativum obtidas de fonte comercial, foram lavadas com água corrente e etanol e posteriormente pulverizadas em moinho. Extrato bruto: 10g de pó para 100ml de solução de NaCl contendo Manganês e Cálcio, 5mM. A suspensão obtida foi filtrada em gaze. O extratos bruto obtido foi centrifugado por 30 minutos a 7500rpm a 4ºC. O resíduo foi rejeitado e o sobrenadante obtido foi submetido ao fracionamento protéico.
Resinas cromatográficas usadas para isolamento e purificação: Q-Sepharose e Sephrose-4B.
Determinação das massas moleculares: utilizou-se padrões conhecidos de massa molecular com grau analítico.
Determinação da atividade hemaglutinante: foi utilizada uma solução da lectina em concentração de 1mg/mL, e ensaiada em presença de hemácias de coelho albino em suspensão a 4%. O título aglutinante da lectina é determinado utilizando diluições seriadas da lectina em placas de microtitulação. A atividade hemaglutinante é expressa pela recíproca da maior diluição onde ainda se observava hemaglutinação macroscopicamente. Para os estudos de inibição da aividade hemaglutinante foram utilizados os seguintes carboidratos: glicose, mannose, galactose, N-acetilgalactosamina, lactose, maltose, metil-manose, glicosamina, rafinose, mio-inositol e fucose
Eletroforese SDS PAGE: em todas as etapas de purificação foram realizadas análises em eletroforese SDS-page a 12%. Foram utilizados padrões de massa molecular internos do laboratório. | | RESULTADOS:
A partir do extrato bruto foi feita uma cromatografia de troca iônica com Q-Sepharose. O perfil da cromatografia nos mostra a presença de atividade em todos os picos que surgem com o aumento da concentração de NaCl. Dessa maneira, presumimos que poderia existir interações mistas de afinidade e carga na resina de Q-Sepharose, uma vez que os resíduos de Gal. poderiam se ligar à lectina além das interações iônicas habituais. O mesmo fenômeno foi também observado na coluna de S-Sepharose (carga negativa). Assim sendo, resolvemos utilizar uma coluna de Sepharose-4B para proceder a separação por um mecanismo exclusivamente de afinidade.
O procedimento utilizado para a purificação da lectina nos possibilitou obter em uma única etapa, uma proteína pura com enriquecimento de 34 vezes.
A migração da lectina em gel de poliacrilamida a 12%, apresenta uma banda única em região de alta peso molecular em relação ao padrão CoNA. Confirmando assim a pureza da referida proteína.
As fração obtida da purificação apresenta um título de hemaglutinação de 128, o que mostra a existência de atividade biológica.
Os resultados do ensaio de especificidade mostram que somente o carboidrato Glicosamina foi capaz de deslocar a lectina das hemácias de coelho, inibindo assim a hemaglutinação. | | CONCLUSÕES:
Nosso trabalho teve sua primeira etapa, que era obter a lectina pura, vencida com sucesso apesar de grandes dificuldades enfrentadas principalmente por causa das particularidades da inédita proteína. A purificação obtida em apenas uma etapa representa uma grande vantagem. A determinação do nível de especificidade por carboidratos permite sondar a forma como as propriedades bioquímicas da proteína determinam suas interações com glicídios presentes na superfície celular, responsáveis por processos de reconhecimento celular e transdução de sinais. O rendimento do nosso processo de purificação da lectina do Coentro ainda não se encontra nos níveis por nós almejados, porém a descoberta de novas particularidades da nossa lectina e a especificidade por outros carboidratos permitirá melhorar o processo de purificação por afinidade. | | | Instituição de fomento: PIP-UFOP | | | Trabalho de Iniciação Científica | | | Palavras-chave: Lectinas; Coentro; Purificação. |
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Anais da 56ª Reunião Anual da SBPC - Cuiabá, MT - Julho/2004 |