IMPRIMIR VOLTAR C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 2. Genética de Microorganismos ANÁLISE DO PERFIL DE RESTRIÇÃO DE UM PLASMÍDEO ISOLADO DE UMA BACTÉRIA PROCEDENTE DO IGARAPÉ DO 40, SITUADO NA CIDADE DE MANAUS. Jackeline Nogueira Pinto 1   (autor)   jnpcardoso@hotmail.com Lucivana Prata de Souza Mourão 2   (orientador)   lucimourao@hotmail.com 1. Graduanda de Ciencias Biológicas, Instituto Cultural de Ensino Superior do Amazonas - ICESAM 2. Profa. MSc em Genética Molecular, Instituto Cultural de Ensino Superior do Amazonas - ICESAM INTRODUÇÃO: Os microorganismos que vivem em ambientes poluídos podem apresentar genes de resistência a antibióticos, ou ainda, genes que codificam proteínas que degradam moléculas tóxicas, garantindo sua sobrevivência nesses ambientes. Esses genes podem ser encontrados no DNA cromossomal, ou em plasmídeos, onde têm a vantagem de poderem ser transferidos para bactérias de espécies diferentes. Os plasmídeos são comuns em bactérias de água doce e são considerados os maiores agentes de transferência de genes entre bactérias. Dentre os vários tipos de plasmídeo, destacando-se pela sua importância, o Plasmídeo R, que confere à célula hospedeira, resistência a antibióticos e antimicrobianos. Na Engenharia Genética, os plasmídeos são utilizados como vetores de clonagem, transportando genes, ou fragmentos de um DNA a ser clonado para dentro da célula hospedeira. Se esse vetor for extraído da célula hospedeira facilita o seu reconhecimento e torna mais eficiente a expressão dos genes. Por isso, plasmídeos extraídos de bactérias de nichos amazônicos são de grande importância para o conhecimento de novos vetores serem utilizados na engenharia genética, na exploração do potencial amazônico, criando alternativas para a preservação do patrimônio genético da região. O presente trabalho teve como objetivo, analisar o perfil de restrição de um plasmídeo isolado de uma bactéria procedente do Igarapé do 40, situado em Manaus, para ser utilizado como possível vetor de clonagem na engenharia genética. METODOLOGIA: As coletas foram realizadas no Igarapé do 40, localizado em zona urbana da cidade de Manaus, próximo ao Distrito Industrial. Neste ponto observa-se uma intensa poluição proveniente de dejetos orgânicos e lixo despejado pelos moradores da área e por substâncias químicas das fábricas do Distrito. A escolha da área deveu-se ao alto índice de bactérias resistentes observado em trabalhos anteriores oferecendo maior possibilidade de se encontrar plasmídeos nas mesmas. As bactérias foram isoladas a partir do método de diluição sucessiva e plaqueadas em meio de cultura contendo o antibiótico Ampicilina (100µg/mL) como agente seletivo. Realizou-se a análise dos microorganismos através do método de Gram e do nível de resistência aos antibióticos Tetraciclina e Cloranfenicol (20µg/mL), utilizando-se a técnica de antibiograma, com escolha aleatória de colônias da placa com ampicilina. Os clones bacterianos que apresentaram crescimento foram considerados resistentes. Dos clones submetidos ao antibiograma, foram selecionados para extração de possíveis plasmídeos, aqueles resistentes a, pelo menos dois antibióticos. Utilizou-se o Kit Concert (High Purity Plasmid Purification Systems) da Life Technologies. A análise da presença de plasmídeo foi feita em eletroforese de gel agarose 0,8% utilizando-se como marcador o plasmídeo extraído da bactéria Enterobacter aglomerans. Para a verificação do perfil de restrição, realizou-se um sistema de digestão com as enzimas Eco RI, Hind III e Bam HI. RESULTADOS: A partir da análise de Gram, observou-se que 72,50%dos clones isolados são Gram-positivos e 27,50%, Gram-negativos. Quanto à resistência aos antibióticos, os resultados obtidos foram que 62,5% mostraram-se resistentes a cloranfenicol e 30%, a tetraciclina. Considerando a resistência dos isolados aos três antibióticos simultaneamente, observou-se que 27,5% foram resistentes aos três antibióticos e que 65% a pelo menos dois. Alguns trabalhos relatam que bactérias que sobrevivem em ambientes poluídos podem apresentar propriedades genéticas como plasmídeo R ou genes de resistência a drogas e substancias tóxicas, obtidas naturalmente como questão adaptativa. A partir dos critérios utilizados para extração de plasmídeos, foram selecionados 26 clones, mas somente um apresentou plasmídeo. A não presença de plasmídeos nessas bactérias resistentes pode ser justificada porque genes de resistência também se encontram no DNA cromossomal e não somente em plasmídeo R ou, porque durante a evolução, pode ter havido a integração do plasmídeo ao cromossomo. Porém, a possibilidade dessas amostras apresentarem plasmídeo não deve ser excluída, devido sua instabilidade que tendem a se perder quando em meio de cultura rico, onde não são essenciais para a viabilidade da célula. Quanto ao perfil de restrição, a partir do sistema de digestão utilizado, observou-se a clivagem do plasmídeo somente com a enzima Eco RI. CONCLUSÕES: Este estudo abre a perspectiva da utilização do plasmídeo isolado como um possível vetor genético, estudos posteriores, tais como análise de restrição com outras enzimas, sequenciamento e transformação genética, são necessários para avaliar a eficiência deste plasmídeo em servir de base para o desenvolvimento de novos vetores para serem utilizados na clonagem molecular. O desenvolvimento de novos vetores é uma atividade essencial para o crescimento biotecnológico em nosso país, em especial na região amazônica, já que a maioria dos vetores está protegida por patentes ou por leis de proteção de cultivares. Vários trabalhos têm descrito o potencial biotecnológico da região amazônica, comprovando que precisamos realizar pesquisas que visem o desenvolvimento de nossos próprios sistemas de clonagem e expressão de genes. Palavras-chave:  Plasmídeo; Enzimas de restrição; Vetor de clonagem. Anais da 56ª Reunião Anual da SBPC - Cuiabá, MT - Julho/2004