| | C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 3. Enzimologia | | | ANÁLISE DO EFEITO PARA DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE GLICEROL SOBRE A Vmáx. DE HIDRÓLISE DE BENZOIL-D,L-ARGININA-para-NITROANILIDA POR TRIPSINA BOVINA NA PRESENÇA DO ÍON BENZAMIDÍNIO. | | | Fabrício Nicula Cintra 1 (autor) niculacintra@hotmail.com | | Nilson Penha-Silva 2 (orientador) |
| | 1. Graduado do Depto.de Ciências Biológicas, Univ. Federal de Uberlândia - UFU | | 2. Prof. Dr. do Inst.de Genética e Bioquímica, Univ. Federal de Uberlândia - UFU |
| | INTRODUÇÃO:
A água é considerada uma condição essencial ao estado vivo. Entretanto, muitos organismos conseguem sobreviver à completa desidratação sem morrer, num estado conhecido por anidrobiose. Outros organismos desenvolveram adaptações que lhes permitem resistir a condições de estresse ambiental, como calor ou altas concentrações de sais. Porém, de uma maneira geral, a capacidade de resistência desses organismos baseia-se na ação de compostos coletivamente designados como osmólitos. Os osmólitos são responsáveis por manter as atividades biológicas das proteínas, estando, desta forma, relacionados à sobrevivência desses organismos, tornando relevante o estudo e compreensão de suas ações. A tripsina é uma enzima proteolítica da família das proteinases serínicas, capaz de catalisar a hidrólise de ligações peptídicas, amida e éster em que o doador do grupo carboxila tenha uma cadeia lateral semelhante às cadeias dos aminoácidos lisina e arginina. O benzoil-D,L-arginina-para-nitroanilida (Bz-D,L-Arg-Nan) é um substrato sintético com uma ligação amida em que a arginina é o aminoácido que doa o grupo carboxila, o que atende às exigências de catálise da tripsina. O íon benzamidínio é um inibidor competitivo de tripsina. No intuito de testar a atividade dos osmólitos, o objetivo do trabalho foi estudar o efeito de 0 a 1 mol.L-1 de glicerol sobre a Vmáx. de hidrólise de Bz-D,L-Arg-Nan pela tripsina bovina na presença do íon benzamidínio. | | METODOLOGIA:
Para a realização do trabalho, os experimentos foram conduzidos em condição apropriadas ao formalismo de Dixon (1953), onde foram utilizadas duas séries de 15 tubos de ensaio cada, que receberam respectivamente 1,3; 1,3; 1,2; 1,1; 1,0; 0,9; 0,8; 0,7; 0,6; 0,5; 0,4; 0,3; 0,2; 0,1 e 0,0 mL da solução tampão tris-HCl 0,1 mol.L-1 pH 8, com 2 mmol.L-1 de CaCl2, a 25 ˚C de temperatura, contendo glicerol na concentração desejada. Em seguida foi adicionado a cada tubo um volume da solução de benzamidina a 0,001 mol.L-1 em tampão pH 8. Posteriormente adicionou-se a cada tubo 0,2 mL de tripsina a 2,0 mg/mL, exceto no tubo 1, que recebeu 0,2 mL de HCl pH 3, servindo como controle. Após pré-incubação a 25 ˚C por alguns minutos, cada tubo recebeu 1 mL das soluções de uso do substrato Bz-D,L-Arg-Nan, sendo S1 (400 μmol.L-1) para uma bateria e S2 (200 μmol.L-1) para outra bateria de tubos. Após incubação por 10 minutos, a 25 ˚C, foram adicionados à cada tubo 0,5 mL de ácido acético a 60% v/v, para interromper a reação enzimática. | | RESULTADOS:
Os dados obtidos para a obtenção da constante de inibição de tripsina bovina pelo íon benzamidínio foram utilizados para testar a determinação da Vmáx. pelos métodos de Lineweaver & Burk (1934), Eisenthal & Cornish-Bowden (1974) e Merino (1974), sendo o método de Lineweaver & Burk (1934) o que melhor se ajustou aos nossos resultados. Após a realização dos cálculos, foi detectado que o glicerol a uma concentração de 0,5 mol.L-1 melhorou a eficiência catalítica da enzima, pelo aumento dos valores de Vmáx., tanto na ausência quanto na presença de concentrações crescentes do íon benzamidínio, ao passo que na concentração de 1,0 mol.L-1 o efeito do glicerol em aumentar a Vmáx. foi menos significativo na ausência do inibidor e, em sua presença, a elevação da Vmáx. decai com o aumento da concentração do inibidor. | | CONCLUSÕES:
A presença de 0 a 1 mol.L-1 de glicerol não afetou a natureza competitiva da inibição da tripsina bovina pelo íon benzamidínio e a presença de concentrações de 160, 320 e 480 μmol.L-1 do íon benzamidínio causou uma diminuição dos valores de Vmáx. de hidrólise de Bz-D,L-Arg-Nan pela tripsina, independentemente da concentração de glicerol utilizada. A incorporação de 0,5 mol.L-1 de glicerol elevou os valores de Vmáx. mesmo na presença de concentrações crescentes do íon benzamidínio, indicando que essa concentração de glicerol não atingiu o ponto de saturação para a reação. Entretanto, a incorporação de 1,0 mol.L-1 de glicerol somente produziu um valor de Vmáx. superior ao valor obtido com 0,5 mol.L-1 de glicerol na ausência do íon benzamidínio, demonstrando uma certa saturação da mistura, o que prejudicou o aumento da Vmáx. para a reação. | | | | | Trabalho de Iniciação Científica | | | Palavras-chave: osmólitos; enzimas; Vmáx. de hidrólise. |
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Anais da 56ª Reunião Anual da SBPC - Cuiabá, MT - Julho/2004 |