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E. Ciências Agrárias - 7. Ciência e Tecnologia de Alimentos - 4. Ciência e Tecnologia de Alimentos

COMPARAÇÃO ENTRE TRÊS MÉTODOS DE PRÉ-PURIFICAÇÃO DE BACTERIOCINA PRODUZIDA POR Lactobacillus sakei 1

Carlos Eduardo Mendes D’Angelis 1 (dangelis@fcfrp.usp.br), Ana Cristina Morseli Polizello 1, Augusto César Cropanese Spadaro 1 e Elaine Cristina Pereira De Martinis 1

(1. Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto - USP)

INTRODUÇÃO: Há crescente preocupação na indústria de alimentos para o controle de microrganismos psicrotróficos causadores de toxinfecções ou deteriorantes. Uma alternativa promissora é o biocontrole, com uso principalmentente, de bactérias láticas (BAL) e/ou seus metabólitos para inibir microrganismos indesejáveis. Algumas BAL podem sintetizar e excretar peptídeos antimicrobianos denominados bacteriocinas. Até o momento, a nisina é a única bacteriocina permitida para a indústria de alimentos, mas há limitações de uso devido à sua inativação em produtos cárneos. Neste sentido, há necessidade de busca de outras bacteriocinas para utilização bem sucedida nestes alimentos. As bacteriocinas são produzidas e excretadas no sobrenadante dos meios de cultura, devendo ser concentradas para posterior purificação. Entre os protocolos de pré-purificação encontram-se precipitação de proteínas com sulfato de amônio, extração com solventes e extração baseada na adsorção e desorção de bacteriocinas nas células produtoras (extração ácida). L. sakei 1, é uma BAL isolada em nosso laboratório, a partir de lingüiça suína e é capaz de inibir Listeria monocytogenes, por meio da produção de bacteriocina. Para a purificação deste peptídeo antimicrobiano três protocolos de extração de bacteriocinas foram experimentados. Para isso as amostras obtidas em cada método foram monitoradas quanto o rendimento, fator de purificação, proteína e atividade específica por meio de dosagem do conteúdo protéico e da atividade inibitória.

METODOLOGIA: Para a separação e concentração da bacteriocina produzida por L. sakei 1 empregou-se três metodologias: Extração ácida descrita por Yang et al. (Appl. Environ. Microbiol., v. 58, p. 3355-3359,1992) e Rosa et al. (J. Food Saf., v. 22, p. 39-54, 2002), extração com clorofórmio proposta por Burianek e Yosef (Lett. Appl. Microbiol., v. 31, p. 193-197, 2000) e precipitação seletiva de proteínas com sulfato de amônio empregada por Muriana e Klaenhammer (Appl. Environ. Microbiol., v. 57, p. 114-121, 1991). A pureza e o rendimento das preparações obtidas, nas diversas etapas de extração foram monitorados por meio de dosagem do conteúdo protéico segundo o método de Bradford (Anal. Biochem. v. 72, p. 248-254, 1976) e da atividade inibitória frente a L. monocytogenes 1/2a como descrito por Mayr-Harting et al. (Methods in Microbiology, v. 7a. New York: Academic Press. 1972. p. 313-342).

RESULTADOS: Em nossos experimentos, a extração ácida empregada para obtenção de bacteriocinas produzidas por L. sakei 1 resultou em amostra com as seguintes características; 1,6 x 104 Unidades Arbitrárias (UA) de atividade total; 0,49 mg de proteína total; 3,26x104 de atividade específica; 0,38 de fator de purificação e 0,25% de rendimento. Em nossas condições laboratoriais, a extração com clorofórmio mostrou-se inadequada, pois não foi possível remover todo o clorofórmio remanescente no sedimento formado após a centrifugação. Este resíduo de solvente interferiu nos ensaios de atividade e na quantificação de proteínas totais sendo obtida atividade total de 4,0 x 103 UA e rendimento de 0,125%. A utilização da técnica de precipitação de proteína com sulfato de amônio resultou nos seguintes valores; 8,0 x 103 UA de atividade total; 10,04 mg de proteína total; 7,96 x 102 de atividade específica; 3,7 de fator de purificação e 0,5% de rendimento.

CONCLUSÕES: A extração ácida empregada para obtenção de bacteriocinas produzidas por L. sakei 1 resultou em fatores de purificação e rendimento inferiores àqueles obtidos com a precipitação com sulfato de amônio. A técnica de extração com clorofórmio apresentou-se inadequada aos nossos objetivos.

Instituição de fomento: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP

Palavras-chave:  Bacteriocina; purificação; peptídeos antimicrobianos.

Anais da 57ª Reunião Anual da SBPC - Fortaleza, CE - Julho/2005