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| C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 6. Bioquímica | ||
| ESTUDOS ESTRUTURAIS PRELIMINARES DE UMA NOVA PROTEÍNA (QUITINASE/HEMAGLUTINANTE) PURIFICADA DE SEMENTES DE Parkia platycephala Benth LEGUMINOSEAE/MIMOSOIDEAE. | ||
| Lia de Carvalho Araújo 1 (araujo_lia@yahoo.com.br), João Batista Cajazeiras 1, Rolando Rivas Castellón 1, Marcos Antonio Pinto Teixeira 1, Plínio de la Torre 1, Benildo Sousa Cavada 1, Walter Filgueira de Azevedo Jr. 2, Frederico Moreno 2, Vicente de Paulo Teixeira Pinto 3 e Celso Shiniti Nagano 1 | ||
| (1. BioMol-Lab, Depto. de Bioquímica e Biologia Molecular, UFC; 2. Depto. de Física, Universidade Estadual de São Paulo (UNESP); 3. Faculdade de Medicina (UFC), Sobral - CE) | ||
| INTRODUÇÃO:
As plantas têm evoluído sofisticados mecanismos de defesa, a grande maioria dos quais, estão concentrados nas sementes, desde que estas são os veículos de propagação e sobrevivência das espécies. Os tecidos das sementes podem acumular constitutivamente, ou após indução, uma ampla série de compostos que conferem resistência contra fitófagos predadores e infecções por vírus, bactérias, fungos e nematóides. Entre as proteínas de plantas presumivelmente envolvidas em mecanismos de defesa contra patógenos e insetos se encontram as glicosilhidrolases (quitinases, glucanases), lectinas, proteínas inativadoras de ribossomos (RIPs tipo 1 e 2) e inibidores de enzimas proteolíticas, entre outras. O isolamento e caracterização de algumas destas moléculas é de fundamental importância na tentativa de entender o papel fisiológico desempenhado pelas mesmas dentro da planta, bem como para avaliar as potencialidades de aplicação em sistemas biológicos particulares ou diversos. O presente trabalho teve como objetivo a caracterização estrutural de uma nova proteína biologicamente ativa (PPL2) purificada a partir de sementes de Parkia platycephala, espécie pertencente à subfamília Mimosoideae (família Leguminoseae). |
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| METODOLOGIA:
A PPL2 foi isolada de sementes de Parkia platycephala por cromatografia de afinidade em coluna de Red_Sepharose. A proteína foi submetida a ensaio de hemaglutinação (eritrócitos de coelho nativos e tratados enzimaticamente). A massa molecular foi determinada por eletroforese em SDS-PAGE, e por MALDI-ToF. A PPL2 foi submetida a cromatografia de afinidade em coluna de quitina. A seqüência N-terminal da PPL2 foi determinada por degradação de Edman usando seqüenciador automático. A seqüência completa foi determinada a partir de DNA genômico, cDNA e 3’RACE por clonagem e transformação em Escherichia coli. Para tal, foi estabelecida uma seqüência parcial usando-se iniciadores (primers) degenerados, desenhados apartir de sequências de aminoácidos por alinhamento múltiplo de quitinases da familia 18. Após a obtenção da seqüência parcial do Gene, foram desenhados primers específicos para realização do 3´RACE (rapid amplification of cDNA ends). Seguidamente foi realizada a amplificação do gene por PCR, e amplificação do extremo 3’ por transcrição reversa (RT). A reação de ligação do sistema plasmidial pGEM-T com o gene amplificado e purificado seguiu a metodologia prescrita pelo fabricante (pGEM-T PROMEGA TECHNICAL). O DNA inserido no plasmídeo foi seqüenciado segundo o método dideoxy (SANGER, 1977) em seqüenciador automático. A PPL2 foi submetida a cristalização usando-se o método de difusão de vapor em matriz esparsa em gota suspensa (JANKARIC & KIM, 1991). |
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| RESULTADOS:
A PPL2 apresentou massa molecular aparente por SDS-PAGE próxima de 28 kDa e por espectrometria de massa, uma massa de 29407.17 Da. A seqüência N-terminal e o alinhamento com proteínas depositadas em banco de dados indicaram alta homologia da PPL-2 com quitinases. Por outro lado, esta proteína foi capaz de aglutinar eritrócitos (coelho), apresentando também alta afinidade por quitina, o que indica a presença de sítios de ligação a carboidratos relacionados com N-acetilglicosamina. Após a formação de microcristais e otimização por semeadura, foram obtidos cristais da PPL2 do tipo ortorrômbicos (P212121), que difrataram a uma resolução de 1.73 Å . A seqüência de aminoácidos foi determinada a partir de DNA genômico, cDNA e 3’RACE por clonagem e transformação em Escherichia coli, e a comparação com a estrutura primária de outras proteínas mostrou que a PPL2 é altamente homóloga ao grupo das glicosilhidrolases (família 18), particularmente com quitinases da classe III, as quais apresentam grupos de aminoácidos conservados como, por exemplo, seis resíduos de cisteína e os aminoácidos cataliticamente ativos (ASP125 e GLU127). A estrutura preliminar da PPL2, determinada por substituição molecular utilizando-se a hevamina (quitinase/lisozima) como modelo, apresentou correlação de 43,9% , Rfactor de 29,7 e Rfree de 33,1%. O alinhamento de seqüência da PPL2 mostrou similaridade acima de 80% com a hevamina. |
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| CONCLUSÕES:
As sementes de Parkia platycephala (Leguminoseae/Mimosoideae) apresentam em seus tecidos uma nova proteína com características de quitinase e que exibe também propriedades hemaglutinantes. Esta proteína (PPL2) apresenta alta homologia com as glicosilhidrolases relacionadas com os mecanismos de defesa de plantas contra microorganismos fitopatogênicos. A seqüência primária determinada por cDNA mostrou que a PPL2 possui alta similaridade com quitinases da classe III, sendo a hevamina um modelo extremamente adequado para estudos de substituição molecular e refinamento estrutural. A PPL2 produziu cristais de alta qualidade que difrataram a uma resolução máxima de 1.73 Å, sendo, portanto, extremamente adequados para estudos cristalográficos de raios X. |
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| Instituição de fomento: CNPq, CAPES, FUNCAP | ||
| Palavras-chave: proteínas de defesa; cristalização; estrutura primária. | ||
| Anais da 57ª Reunião Anual da SBPC - Fortaleza, CE - Julho/2005 |