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| C. Ciências Biológicas - 1. Biofísica - 3. Biofísica Molecular | ||
| ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DE UMA LECTINA DE SEMENTES Canavalia marítima NATIVA E LIGADA A MALTOSE E TREALOSE | ||
| Raquel Guimarães Benevides 1 (raquelgb@gmail.com), Plínio Delatorre 1, 3, Carlos Alberto de Almeida Gadelha 2, Tatiane Santi-Gadelha 2, Bruno Anderson Matias Rocha 1, Walter Filgueiras De Azevedo 4, Frederico Bruno Mendes Batista Moreno 4, Beatriz Tupinambá Freitas 3, André Luís Herzog Cardoso 3 e Benildo Sousa Cavada 1 | ||
| (1. Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará - UFC.; 2. Departamento de Bioquímica, Universidade Federal da Paraíba - UFPB; 3. Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Regional do Cariri - URCA; 4. Departamento de Física, Universidade Estadual Paulista - UNESP) | ||
| INTRODUÇÃO:
O principal objetivo deste trabalho foi a cristalização e resolução da estrutura tridimensional da lectina de sementes Canavalia maritima, tanto na forma pura (nativa) como complexada com carboidratos visando um melhor entendimento da interação proteína-carboidrato e das bases estruturais de possíveis diferenças encontradas em ensaios de atividade biológica quando comparada a outras lectinas da sub-tribo Diocleinae. Lectinas têm sido encontradas em muitos organismos, desde vírus e bactérias até plantas e animais. Em plantas, as lectinas purificadas de espécies da família Leguminosae, formam o grupo mais estudado de proteínas que se ligam a carboidratos. Apesar das lectinas de plantas terem sido descobertas há mais de um século, e de hoje algumas destas moléculas terem se tornado tão importantes que possam ser consideradas como insumos básicos em biotecnologia, a função ou funções destas proteínas dentro das plantas onde ocorrem permanecem ainda obscuras. Entretanto, muitas funções têm sido propostas para as lectinas, tais como: proteção contra patógenos e insetos, transporte e armazenamento de carboidratos, reconhecimento celular (dentro da célula, entre células ou entre organismos), proteínas de reserva ou reguladores de crescimento. Uma das características mais marcantes das lectinas de leguminosas é a sua variabilidade de estrutura quaternária; embora a estrutura de seus monômeros seja altamente similar, eles podem se associar em números diferentes de tetrâmeros e dímeros. |
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| METODOLOGIA:
A lectina de Canavalia maritima (ConM) foi diluída homogeneamente em tampão Tris-HCl 1 mM pH 7,0 contendo 5 mM CaCl2 e 5 mM de MnCl2 numa concentração de 40 mg/ml. Cristais de tamanho exagerado foram obtidos em Tampão Hepes 0,1M pH 7,5 com 2% v/v de Polietileno Glicol 400 e 2M de sulfato de amônio. Para a obtenção de cristais de ConM complexados com açúcares, alguns dos melhores cristais, tiveram suas gotas banhadas com 1 mL de uma solução com concentração de 1mM de maltose ou trealose. Os dados de difração de raios-X em cada caso foram coletados a partir de um único cristal, mantido com nitrogênio a uma temperatura de 100 K. A coleta de dados foi feita num comprimento de onda de 1,4727 Å usando-se fonte de radiação Síncrotron (LNLS). Foram coletadas 120 imagens dos cristais contendo a lectina pura de ConM a uma resolução de 1,56 Å, 120 imagens de ConM complexada com maltose a uma resolução de 1,87 Å e 160 imagens do cristal de ConM complexada com trealose a uma resolução de 2,00 Å, todas numa amplitude de oscilação de 1,0o. Os conjuntos de dados foram escalonados e indexados. As estruturas tridimensionais da ConM (nativa e complexadas) foram determinadas por substituição molecular usando o programa MolRep. A estrutura inicial foi submetida a refinamentos de corpo rígido e posicional usando o programa REFMAC5 do pacote de programas CCP4 (COLLABORATIVE COMPUTATIONAL PROJECT, N 4, 1994). A análise do mapa de densidade eletrônica foi feita usando programa XtalView (McREE, 1999). |
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| RESULTADOS:
As estruturas tridimensionais das lectinas de ConM nativa e complexada com maltose e trealose foram determinadas por substituição molecular e submetida a refinamentos de corpo rígido e posicional, tendo Rfactor e Rfree convergido para 19,83% e 24,82% na estrutura nativa, Rfactor de 20,73% e Rfree de 26,10% para ConM complexada com maltose, e Rfactor de 19,27% e Rfree de 24,42% para ConM complexada com trealose. Com base na seqüência de aminoácidos determinada por densidade eletrônica, foi feita a correção de 12 resíduos de aminoácidos duvidosos na seqüência manual. Os monômeros são formados por 16 fitas β interconectadas por voltas e “loops” e por três α-helices. Dois dímeros canônicos associados por fitas β em contato cruzado (cross-link) formam a estrutura quaternária da ConM. Os contatos da interface beta-beta e as pontes de hidrogênio estabilizam os dímeros canônicos. Oito resíduos nos sítios C1 e C2 interconectam os dímeros canônicos. A interação em C1 é uma ligação cruzada entre ácido aspártico (ASP78) e arginina (ARG60) nas cadeias A e D (Figura 5.7C), e nas cadeias B e C. Outras interações na mesma linha ocorrem entre resíduos treonina (TRE49) e serina (SER119) estabilizam a estrutura. A densidade eletrônica para os “loops” de ConM é fraca ou simplesmente não aparece em duas dessas regiões 118-121 e 160-163. O sítio de ligação a carboidratos de ConM apresenta potencial eletrostático negativo, conforme calculado pelo programa Swiss PdbViewer 3.7. |
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| CONCLUSÕES:
As estruturas tridimensionais das lectinas purificadas de sementes de Canavalia maritima pura (1,95 Å) e complexadas com os maltose (1,71 Å) e trealose (1,78 Å) apresentaram boa qualidade estereoquímica e conformação esperada para lectinas de leguminosas. Os aminoácidos envolvidos na ligação a metais são conservados e a estrutura dos sítios de ligação a Mn2+ e Ca2+ mostra similaridade com aqueles determinados em outras lectinas de leguminosas Diferenças mais significativas entre a estrutura da ConM e o modelo da ConA estão nas regiões 68-70, 119-122, 135-137, 149-153, 161-163 e 170-171. Algumas dessas diferenças estruturais entre as subunidades de ConM ocorrem principalmente nas regiões dos loops. Estas regiões ou estão envolvidas nos contatos do cristal ou possuem pequenos contatos com outras partes da proteína. As diferenças apresentadas entre os modelos provavelmente são reais uma vez que os átomos envolvidos possuem baixos fatores de temperatura. |
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| Instituição de fomento: Funcap, Urca, Capes, CNPq | ||
| Trabalho de Iniciação Científica | ||
| Palavras-chave: Cristalografia de proteínas; Canavalia maritima; Lectina. | ||
| Anais da 57ª Reunião Anual da SBPC - Fortaleza, CE - Julho/2005 |