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| C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 3. Enzimologia | ||
| IDENTIFICAÇÃO E PARCIAL PURIFICAÇÃO DE GLICOSIDASES DO ECHINODERMA HOLOTHURIA GRICEA. | ||
| Juliana Maria Costa da Silva 1 (biologaufrn@yahoo.com.br), Maria Lúcia Lira Andrade 1, Luciana Duarte M. da Matta 1 e João Felipe de Sousa Filho 1 | ||
| (1. Depto. de Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN) | ||
| INTRODUÇÃO:
Glicosidases, também denominadas carbohidratases, são enzimas incluídas na classe (3. -) da classificação de enzimas (I.U.B. 1979), que catalizam a hidrólise de glicoconjugados (glicoproteínas, glicolipídios e glicosaminoglicanos) e de substratos sintéticos que contém ligações glicosídicas Muitas glicosidases são endoglicosidases que quebram ligações internas e liberam oligossacarídeos, entretanto, existe um grande número de glicosidases chamadas exoglicosidases que agem na extremidade da cadeia do carboidrato e liberam monossacarídeos. Enzimas envolvidas na degradação dos glicosaminoglicanos sulfatados estão distribuidas em várias espécies de invertebrados. Este trabalho foi desenvolvido para identificar endo e exo-glicosidases envolvidas na degradação de glicosaminoglicanos sulfatados,presentes em invertebrados como os echinodermatas. O presente trabalho tomou como objeto de estudo a espécie Holothuria gricea,conhecida popularmente como Pepino-do-Mar. Não existem dados sobre a presença de glicosidases no echinodermata em questão, sendo portanto relevante investigar a presença e atividade dessas enzimas, uzando-as como ferramenta no estudo das estruturas destes açucares complexos. |
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| METODOLOGIA:
Foi obtido o extrato enzimático através da homogeneização, utilizando-se do equipamento Van Potter como também do equinordemata Holothuria gricea, usando tampão Acetato de Sódio 0,1M, pH 5,0 a 4ºC. O extrato enzimático foi em seguida centrifugado e submetido a fracionamento com Sulfato de Amônia em diferentes concentrações: 0-50% e 50-80% obtendo respectivamente, F1 e F2. A atividade enzimática foi determinada com substratos naturais : Condroitim Sulfato e Heparam Sulfato através de incubações over-night realizadas com as frações F1 e F2 e posterior corrida eletroforética em Gel de Agarose.A dosagem protéica foi realizada utilizando-se do reagente de Bradford e evidenciou-se uma maior concentração protéica na F2, onde foi submetido a um novo fracionamtento, utilizando Bio-gel A 1,5m, eluindo esta fração em tampão.Para teste enzimático com substratos sintéticos foram realizadas incubações com os mesmos e alíquotas de F2 advindas da eluição da coluna de Bio-Gel A 1.5m.Alíquotas de 100µl de cada fração eluída da coluna do gel foram utilizados para os testes enzimáticos. Essas alíquotas foram incubadas com p-nitrofenil derivados de açúcares:ß-galactopiranose (substrato1), D-glucopiranosídeo (substrato2), p-monopiranosídeo (substrato3), Nac-glucosaminídeo (substrato 4) , numa concentração de 2mg/ml à 37°C por 4 horas.As amostras foram lidas no espectrofotômetro a uma D.O de 405nm para os tubos com os substratos a 280nm para os tubos somente com a eluição de F2. |
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| RESULTADOS:
O Condroitim foi totalmente degradado pelo F2, diferentemente do Heparam que apresentou baixa degradação. Tal resultado foi obtido pela desaparecimento do polímero visualizado por eletroforese em Gel de Agarose e corado com Azul de Toluidina. Sendo o F2 submetido a um novo fracionamtento, utilizando Bio-gel A 1,5m e a realização de incubações com os substratos citados e as frações eluídas, obteve-se desta forma, um perfil enzimático das glicosidases presentes no Holothuria: ß-manosidase, α-Glucopiranosidase, Nac-Glucosaminidase, ß-Galactopiranosidase. Sendo observado que a Nac-Glucosaminidase e a ß-Galactopiranosidase encontram-se em uma concentração maior por apresentarem picos de atividade no gráfico realizado para observação do perfil das atividades enzimáticas com os substratos sintéticos citados. |
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| CONCLUSÕES:
Esses resultados sugerem uma identificação das citadas enzimas no Holothuria gricea, informação ausente na literatura e um certo grau de purificação obtido, apresentando uma capacidade de isolar e caracterizar glucuronidases. |
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| Instituição de fomento: CNPq | ||
| Trabalho de Iniciação Científica | ||
| Palavras-chave: glicosidases; Holothuria gricea; glicosaminoglicanos. | ||
| Anais da 57ª Reunião Anual da SBPC - Fortaleza, CE - Julho/2005 |