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| C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 6. Bioquímica | ||
| PADRONIZAÇÃO DA TÉCNICA DE HOMOGENEIZAÇÃO DOS CORTES EM CRIOSTATO DE CÉREBRO DE RATO Winstar | ||
| Renata Roland Teixeira 1 (rolandteixeira@yahoo.com), Luciana Karen Calábria 1 e Foued Salmen Espindola 1 | ||
| (1. Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia - UFU) | ||
| INTRODUÇÃO:
Um dos modelos experimentais para o estudo de processos de isquemia e injúria de tecidos são as fatias de cérebro, uma vez que conservam praticamente todas as conexões existentes no tecido. O estudo de cortes de cérebro em criostato, homogeneizados e submetidos a uma bateria de condições é um método útil no entendimento dos aspectos da alteração sináptica. Entretanto, a diversidade de métodos utilizados na preparação de cortes de cérebro pode refletir nos resultados finais. Sendo assim, visou-se à padronização da técnica de homogeneização dos cortes de cérebro de rato para a detecção da miosina-V (M-V), um motor molecular envolvido em diversos eventos celulares como o transporte e a reciclagem de vesículas sinápticas. |
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| METODOLOGIA:
Realizaram-se cortes frontais seriados de 5µm, sendo que em cada lâmina foram colocados quatro cortes um sobre o outro, somando 20µm. As fatias foram removidas com auxílio de lamínulas e homogeneizadas de três maneiras diferentes: em tampão de extração de M-V pH 7.7 contendo inibidores, quelantes e ATP; em ácido tricloroacético (TCA) 10% e em tampão de extração de M-V pH 7.7 contendo inibidores, quelantes e ATP, sendo que posteriormente a amostra foi incubada com TCA 10% por 15 minutos no gelo e centrifugada. Foram aplicadas 10 µg de proteína da amostra em gel SDS-PAGE 5-16%. A partir de Western blot transferiram-se as proteínas separadas no gel SDS-PAGE para membrana de nitrocelulose. Incubou-se a membrana com anticorpo primário anti-cabeça de M-V e anticorpo secundário conjugado com fosfatase alcalina. As membranas foram reveladas com NBT/BCIP. |
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| RESULTADOS:
Observou-se que não houve alteração no perfil protéico independentemente do tampão utilizado para homogeneização dos tecidos. Por Imunoblot detectou-se uma banda específica de massa relativa de 190 kDa correspondente a M-V. Nas fatias homogeneizadas somente com TCA a visualização dessa banda protéica foi fraca quando comparada com homogeneizados preparados somente com tampão de extração de M-V ou quando se adicionou TCA a este. Portanto, a homogeneização do tecido diretamente no tampão de extração de MV mostrou-se mais eficiente devido a melhor visualização da marcação correspondente a esse motor molecular, à rapidez na homogeneização, evitando a degradação de proteínas; e quanto à especificidade já que este é um tampão utilizado em experimentos de extração e purificação para MV. |
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| CONCLUSÕES:
Os resultados aqui apresentados nos permite concluir que a padronização da preparação de fatias de cérebro de rato por congelamento para a imunodetecção da MV é um grande avanço já que abre perspectivas para novos estudos envolvendo a MV em condições in situ, assim como outras proteínas envolvidas nos processos de transmissão sináptica e reciclagem de vesículas. |
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| Instituição de fomento: FAPEMIG e CNPq | ||
| Trabalho de Iniciação Científica | ||
| Palavras-chave: cortes de cérebro; criostato; miosina-V. | ||
| Anais da 57ª Reunião Anual da SBPC - Fortaleza, CE - Julho/2005 |