Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM) uma das

mais prevalentes micoses sistêmicas na América Latina. Trata-se de um fungo

termodimórfico que transita entre a forma miceliana saprófita à temperatura ambiente e a

forma leveduriforme parasitária à temperatura do hospedeiro mamífero. Para o

estabelecimento da PCM o fungo P. brasiliensis tem que interagir com um ambiente hostil,

que corresponde à resposta do sistema imune do hospedeiro com alta produção de EROS, e

para isso desenvolveu mecanismos contra os danos oxidativos, o que inclui a síntese de

enzimas antioxidantes. A tiorredoxina (TRX) é uma proteína pequena (~12 KDa) contendo

um sítio ativo conservado Cys-Gly-Pro-Cys, é reduzida pela TRX redutase e está envolvida

na defesa antioxidante, redução de ribonucleotídeos e a redução de peroxidases e fatores de

transcrição (Rahlfs et al., 2002).

Considerando que a sobrevida do fungo no hospedeiro é um fator essencial para o

estabelecimento da infecção, o estudo da TRX na resposta ao estresse oxidativo em P.

brasiliensis permitirá um maior entendimento no que diz respeito ao processo de adaptação do

fungo no hospedeiro. O presente trabalho tem como objetivo o estudo e análise da expressão

da TRX sob condições normais de cultivo e sob estresse térmico e oxidativo, e a comparação

da sequência de aminoácidos da TRX de P. brasiliensis (PbTRX) com sequências de outros

organismos existentes em banco de dados para a definição de motivos e construção de árvore

filogenética.

Análises de homologia e árvore filogenética

A seqüência de aminoácidos da PbTRX (n° de acesso GenBank AAQ84040) foi comparada

com as seqüências de outros organismos obtidas em banco de dados através do programa

BLAST (Altschul et al., 1997). As sequências foram alinhadas pelo programa

CLUSTAL (Thompson et al., 1997) e a árvore filogenética foi produzida pelo programa Tree View

(Page, 1996).

Cultivo do fungo

Foi utilizado o isolado Pb01 (coleção ATCC, MYA, 826) do fungo P. brasiliensis cultivado

em meio Fava-Neto em estufa a 26°C para a forma de micélio e 37°C para a forma de

levedura.

Análise do crescimento de células leveduriformes de P. brasiliensis em condições de

estresse oxidativo

Foi utilizado um grupo controle cultivado em condições normais e um grupo tratado com 25

mM do agente oxidante H₂O₂. Os dois grupos foram submetidos a uma suave rotação a 37°C

por 3 horas, ao que se seguiu a padronização do inóculo em 1x106 células/mL de meio (YPD).

As células dos dois grupos foram contadas em Câmara de Neubauer por 7 dias e a média das

contagens de quatro experimentos, sendo feito triplicata para o grupo controle e tratado em

cada um desses experimentos, foi utilizada para a construção de uma curva de crescimento.

Eletroforese de proteínas e Western blotting

As células micelianas e leveduriformes de P. brasiliensis submetidas ao estresse térmico por

inversão da temperatura normal a cada tipo de célula e as células leveduriformes de P.

brasiliensis cultivadas em condições normais e de estresse oxidativo como citado

anteriormente foram submetidas à extração de proteínas. Os extratos protéicos foram

fracionados por eletroforese unidimensional (Laemmli, 1970) e bidimensional (O' Farrel, 1975).

Em seguida as proteínas foram coradas por azul de Comassie ou transferidas para membranas

de nitrocelulose para a realização do Western blotting segundo (Sambrook et al., 1989)

utilizando o anticorpo primário anti-TRX de E. coli (Sigma) e o anticorpo secundário anti-IgG de

coelho acoplado à fosfatase alcalina. As membranas foram reveladas pelo sistema BCIP/NBT.

Extração do RNA total de P. brasiliensis e obtenção da sonda homóloga

As células micelianas e leveduriformes de P. brasiliensis foram submetidas à extração de

RNA pelo método Trizol (GIBCOTM Invitrogen Corporation). A sonda homóloga foi obtida

via PCR usando primers construídos com base na sequência 5’ e 3’do cDNA da Pbtrx1.

Análises de homologia e árvore filogenética

As análises realizadas permitiram identificar uma região de aminoácidos conservados em

diferentes organismos, essa região corresponde ao sítio ativo das TRXs. A PbTRX

demonstrou maior identidade e similaridade com a sequência do organismo também

pertencente ao Reino Fungi Saccharomyces cerevisiae, apresentando 57% de identidade e

76% de similaridade. A análise filogenética demonstra a ampla distribuição da TRX entre os

organismos, estando presente em organismos procarióticos e eucarióticos. A PbTRX aparece

na árvore filogenética agrupada no clado dos fungos.

Curva de crescimento

A contagem das células leveduriformes de P. brasiliensis em Câmara de Neubauer mostrou

que o grupo tratado apresentou menor capacidade de crescimento, no entanto a taxa de

crescimento observada indica que o fungo possui mecanismos de defesa contra a situação de

estresse ao qual foi submetido, mantendo-se viável. Podemos então sugerir que assim como

acontece com outros organismos (Jamieson, 1998), as células leveduriformes de P. brasiliensis

são resistentes ao tratamento com H₂O₂.

Western blotting

A realização do Western blotting permitiu a visualização de uma banda na região

correspondente à TRX (~12 KDa e pI~5,19), no entanto não foi possível determinar se houve

ou não um aumento da expressão da PbTRX em condições de estresse. Nota-se que ela está

sendo expressa tanto nas células em transição como nas células do grupo controle e tratado e

isto é um indicativo do importante papel desta proteína em situações que expõem o fungo a

algum tipo de estresse, seja ele térmico ou oxidativo. Esses dados serão confirmados pela

utilização de anticorpo primário anti-PbTRX após a expressão e purificação da proteína

recombinante em E. coli (experimentos em andamento).

 

Os resultados apresentados mostraram que a proteína PbTRX é altamente conservada

nos mais diversos organismos o que também é evidenciado nas análises de filogenia.

O comportamento das células leveduriformes de P. brasiliensis quando submetidas às

condições de estresse oxidativo foi de acordo com o esperado o que corrobora com a

afirmação de que o fungo é afetado de alguma forma pelos danos causados pela formação das

EROS, da mesma forma a taxa de crescimento das células tratadas com o agente oxidante

demonstra a capacidade do fungo em defender-se do estresse oxidativo.

A realização do Western blotting permitiu uma análise da expressão da PbTRX

quando o fungo é submetido a situações de estresse, sendo expressa em todos as situações

analisadas, tanto na diferenciação de micélio para levedura como na diferenciação de levedura

para micélio. Resultado similar foi observado nas culturas controle e tratada com agente

oxidante. Essas análises serão melhor evidenciadas pela realização do Western blotting com o

anticorpo obtido após a expressão e purificação da proteína PbTRX recombinante.

Instituição de fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico/ CNPq

Trabalho de Iniciação Científica