| C. Ciências Biológicas - 1. Biofísica - 4. Radiologia e Fotobiologia |
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AÇÃO FOTODINÂMICA EM SISTEMAS MODELO E MITOCÔNDRIAS ISOLADAS |
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| Priscila Afonso de Faria 1 |
| Sérgio Brochsztain 1 |
| Tiago Rodrigues 1 |
| Iseli Lourenço Nantes 1 |
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| (1. CIIB, Universidade de Mogi das Cruzes (UMC), Mogi das Cruzes/SP, Brasil) |
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| INTRODUÇÃO: |
N, N'-bis(2-fosfanoetil)-1,4,5,8-naftalenodiimida (PNDI) é um composto aromático que apresenta propriedades fotoquímicas interessantes. Este composto pode ser reduzido, química ou fotoquimicamente, gerando um ânion radical imida estável, capaz de reduzir o ferro (III) do citocromo c (cit c). O citocromo c é uma hemoproteína que participa do transporte de elétrons na cadeia respiratória na membrana mitocondrial interna e apresenta atividade de peroxidase, ou seja, reage com peróxidos gerando radicais livres que podem atacar a própria proteína, causando bleaching da banda Soret ou, se em lipossomos, esses radicais, além de atacar a proteína, podem atacar os lipídeos causando a lipoperoxidação. A digestão proteolítica do citocromo c resulta em hemopeptídeos denominados microperoxidases, que também apresentam atividade de peroxidase. A microperoxidase-8 (MP-8) é um destes hemopeptídeos e possui oito resíduos de aminoácidos, sendo estes de cisteína-14 a glutamato-21. Neste trabalho, nós avaliamos o potencial fotoprotetor do ânion radical de PNDI gerado fotoquimicamente, sobre citocromo c, microperoxidase-8, mitocôndrias isoladas de fígado de rato e lipossomos de fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina e cardiolipina contra radicais livres. |
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| METODOLOGIA: |
- Para a irradiação das amostras foi utilizada uma lâmpada UV Model UVGL-25 Multiband UV 254/365nm, 4Watts de potência.
- As alterações na estrutura do citocromo c e da microperoxidase-8 foram avaliadas por espectrofotometria UV-vis, utilizando um espectrofotômetro Photodiode Array MultiSpec-1501 (Shimadzu Co., Kyoto, Japão).
- Para o preparo dos lipossomos uma alíquota de lipídios na proporção de 50% de fosfatilcolina, 30% de fosfatidiletanolamina e 20% de cardiolipina na concentração de 1,0 mmol/L foi solubilizada em clorofórmio, o qual foi eliminado sob fluxo de argônio. O filme lipídico resultante foi ressuspendido em tampão fosfato de sódio 10 mmol/L, pH 7.4, e os lipossomos preparados por meio de sonicação.
- A lipoperoxidação foi avaliada por meio da formação de malondialdeído (MDA) determinado espectrofotometricamente. A amostra foi incubada por 30 min, a 37ºC, seguida da adição de ácido tiobaritúrico (TBA) 1% (m/v), 0,1 mL de NaOH 10 mol/L e 0,5 mL de ácido fosfórico 20% (v/v), e incubado por 20 minutos a 85ºC. O complexo MDA-TBA foi extraído com 2 mL de n-butanol e a absorvância determinada em 532 nm.
- As análises matemáticas, estatísticas e gráficas foram realizadas utilizando o programa Microcal Origin 6.0 (MicrocalTM Software, Inc.). |
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| RESULTADOS: |
A reação de cit c com peróxidos em meios homogêneos e heterogêneos gera radicais livres que podem atacar a proteína levando ao bleaching da banda Soret do cit c. Em ambos os meios, PNDI irradiado foi capaz de proteger o cit c devido a sua capacidade de reduzir o ferro hemínico, inibindo assim, a reação deste com os peróxidos. O efeito fotoprotetor não foi observado quando o cit c foi substituído por MP-8, pois PNDI não foi capaz de reduzir o ferro hemínico da MP-8. Quando cit c ou MP-8 estão incorporados em lipossomos observa-se danos aos lipídeos devido à reação do ferro hemínico com as cadeias acílicas peroxidadas presentes no lipídeo. Nestes sistemas a presença de PNDI irradiado diminuiu a lipoperoxidação e a proteção foi significativamente mais elevada quando foi utilizado cit c. No sistema cit c/PCPECL ou MP-8/PCPECL, a adição de t-BuOOH não mudou significativamente os danos aos lipídeos, mas a adição de HOOH diminuiu significativamente a lipoperoxidação promovida pelo cit c ou MP-8. Na presença dos peróxidos, PNDI irradiado também protegeu a bicamada lipídica. PNDI no estado fundamental aumentou o dano promovido pelo cit c ou MP-8 na presença ou na ausência dos peróxidos. Passamos a investigar se esta fotoproteção pelo PNDI também ocorreria em sistemas biológicos. Utilizando mitocôndrias isoladas, nossos resultados preliminares mostraram que PNDI irradiado inibiu aproximadamente 50% da lipoperoxidação da membrana mitocondrial induzida por Fe2+/citrato. |
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| CONCLUSÕES: |
PNDI no estado fundamental não é capaz de proteger o citocromo c, a microperoxidase-8 e os lipídeos contra o ataque de radicais livres. Observa-se um pequeno aumento do dano ao lipídeo na presença de PNDI no estado fundamental e excitado, devido a perturbações na estrutura da bicamada lipídica na ausência de indutores de lipoperoxidação. Por outro lado, na presença de indutores, PNDI apresenta um efeito fotoprotetor decorrente da geração do seu ânion radical, sendo que este efeito parece envolver a remoção de radicais livres e a redução do ferro (III) hemínico. Como os peróxidos competem com as cadeias acílicas peroxidadas presentes nos lipídeos para a reação com o ferro (III) hemínico, o dano ao lipídeo é menor na presença de HOOH, pois os radicais gerados pela reação deste peróxido com as peroxidases são relativamente mais polares que os gerados por t-BuOOH. O efeito fotoprotetor é menor na presença de microperoxidase-8, pois este hemopeptídeo, sendo mais hidrofóbico que o citocromo c, se difunde mais para o interior da bicamada, dificultando a transferência de elétrons do ânion radical de PNDI para a microperoxidase-8. Como a fotoproteção também foi observada em sistemas biológicos, experimentos adicionais serão realizados para a elucidação do mecanismo fotoprotetor de PNDI em mitocôndrias isoladas. |
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Instituição de fomento: FAPESP, CNPq e FAEP-UMC
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Trabalho de Iniciação Científica
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Palavras-chave: N, N'-bis(2-fosfanoetil)-1,4,5,8-naftalenodiimida; citocromo c; peróxidos. |
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| Anais da 58ª Reunião Anual da SBPC - Florianópolis, SC - Julho/2006 |
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