Após a transferência nuclear (TN) ocorrem eventos que podem influenciar o desenvolvimento embrionário. Imediatamente na fusão, o envelope nuclear da célula doadora se rompe e os cromossomos condensam devido à ação dos altos níveis de MPF presentes em oócitos maturados até a metáfase II (1). O DNA das células nas fases do ciclo celular G0 ou G1 condensa formando cromátides simples quando transferidas em oócitos pré-ativados. O material genético é então replicado, juntamente com o rearranjo do envelope nuclear, para que ocorra o processo de divisão celular com manutenção da ploidia (2).  Células em G0 tem redução na transcrição e tradução, estando em condição que permitiria à cromatina responder aos fatores citoplasmáticos oocitários controladores de expressão gênica (3).

CAMPBELL et al. (1996) sugeriram a privação de soro no meio de cultura para sincronizar as células em G0 como demonstrado por KUES et al. (2000) e BOQUEST et al. (1999). Outro método de sincronização das culturas celulares é o emprego de drogas capazes de inibir o ciclo em determinadas fases.

A cicloheximide (CHX) é um inibidor de síntese protéica, sendo utilizada para bloquear a meiose em oócitos. O objetivo deste estudo foi avaliar o estágio do ciclo celular de fibroblastos fetais suínos por citometria de fluxo após carência de soro fetal bovino (SFB) ou administração de CHX assim como a viabilidade dessas células.

Feto suíno com aproximadamente 45 dias de gestação foi fragmentado. Os fragmentos de pele foram colocados em cultivo com meio Dulbecco’s Modified Eagle’s Mediuim (DMEM) adicionado de 10% de soro fetal bovino (SFB) e 50 mg/ml de gentamicina. Os fibroblastos foram sub-cultivados até a 5^a passagem e quando atingiram a semi-confluência tiveram seus meios de cultivo substituídos pelos meios “Carência” (DMEM +0,5%SFB), “CHX” (DMEM+ 10mg/ml CHX) ou manteve-se o meio com 10% SFB como controle.

Foram colhidas amostras para avaliação do estágio do ciclo celular no intervalo de um a seis dias em carência de SFB e após 12, 24 e 48 horas sob ação da CHX. As células colhidas foram fixadas no etanol 70% e ressuspendidas em 1ml de PBS. Um total de 500ml foram incubados com 10ml de iodeto de propídeo e 10ml de RNAse por 1h a 42°C.

A suspensão de células foi avaliada no citômetro de fluxo FACScalibur associado a um computador Macintosh com o programa Cell Quest, o qual gerou os arquivos com gráficos para posterior análise. Para análise em computador plataforma Windows, foi utilizado o programa FACSExpress. Os dados foram analisados por qui-quadrado com p<0,05%, utilizando-se do programa BioEstat 3.0.

As células em cada tratamento foram fixadas em ALFAC (álcool 80%, formalina 40% e ácido acético) e coradas com hematoxilina e eosina. Foram então observadas em microscópio de epifluorescência.

Carência de SFB promoveu aumento na proporção de células em G0/G1 apenas após 1 ou 2 dias (d) em relação ao controle, mas sem diferença estatística. Foi observada queda (p<0,05) na proporção de células em G0/G1 e G2/M aos 3d e aumento de debris celulares. A proporção de debris se manteve aumentada até 6d e a proporção de células em G2/M se manteve similar ao controle após 5d e 6d. Com CHX, observa-se redução das células em G0/G1 e G2/M após 24 e 48h de tratamento e aumento de debris (p<0,05).

Células carenciadas por 1, 2 ou 3d, ao microscópio, não apresentaram alterações morfológicas. Após 4d, algumas células mostraram alterações de contorno citoplasmático indicando lesão celular. Após 5d em carência, observou-se aumento na eosinofilia, indicando lesão celular. Após 6d apresentaram alterações morfológicas como citoplasma heterogêneo, com desorganização dos filamentos citoplasmáticos e deterioração morfológica; difícil visualização dos limites celulares e nucleares, com redução da basofilia nuclear, indicando provável cariólise e picnose.

Fibroblastos tratados por 12h com CHX apresentaram-se similares ao controle. Após 24h observou-se deterioração morfológica, núcleos deslocados para a periferia, provavelmente por alterações no citoesqueleto, redução da basofilia nuclear e cariorexis. CHX por 48h promoveu alterações morfológicas como heterogeneidade do citoplasma, degeneração morfológica, deslocamento nuclear para a periferia, cariorexis e alta eosinofilia citoplasmática. 

Similar ao trabalho de KUES et al. (2000), este estudo mostra que a carência de SFB pode causar efeitos rápidos sobre o ciclo celular de fibroblastos suínos. Porém, após 3 dias da carência, já não se observa a concentração de células na fase G0/G1 do ciclo, diferente do relatado por KUES et al. (2000) nesse mesmo período de tratamento.

O SFB contém diversas proteínas, polipeptídeos, hormônios, nutrientes, metabólitos e minerais, além de outros componentes não determinados. A diminuição da concentração desses nutrientes no meio pode explicar as lesões celulares encontradas.

O uso da CHX permitiu um aumento da proporção de células em G0/G1 apenas com 12h de exposição, porém esse aumento foi menor que aquele observado na carência. Com 24 e 48h de tratamento o efeito da CHX foi tóxico para as células, devido ao grande número de debris observados pelo citômetro e de lesões visualizadas no microscópio. Por ser um inibidor de síntese proteica, a CHX pode estar interferindo com a síntese de proteínas vitais para o funcionamento celular.

Foi concluído que células em carência de SFB por 1 ou 2 dias são as mais indicadas para TN em suínos, pois longos períodos de carência são prejudiciais às células. As células submetidas a 10 mg/ml de CHX por 12 a 48h não são indicadas para TN em suínos.