A pele humana é notavelmente uma eficiente barreira orgânica que permite a regulação da perda transpidermal de água e da temperatura do nosso corpo, além de nos proteger contra os efeitos nocivos dos agentes químicos externos ou microorganismos. A pele oferece uma conveniente rota para administração de agentes terapêuticos em nosso corpo. Apesar da maioria das drogas serem administradas oralmente, para uma variedade delas, esta rota de administração não é viável devido à alta atividade metabólica  do fígado (nos primeiros passos do metabolismo) e do trato gastrintestinal. Apesar de atrativa e vantajosa, a aplicação transpidermal de fármacos enfrenta alguns obstáculos. O principal deles é o Estrato Córneo (EC), camada mais externa da pele (10-15 mm de espessura) que é pouco permeável. O EC desempenha um papel protetor contra a entrada de substâncias ou microorganismos no corpo. Qualquer agressão que o atinja resulta em uma maior permeabilidade e conseqüente desidratação da pele.

Entender a função de barreira à permeabilidade da pele é importante para se estabelecer um modelo adequado do sistema de transporte de drogas transpidermais como também para o nosso entendimento de sua etiologia, e possíveis tratamentos de um vasto número de doenças de pele no qual a função de barreira fica comprometida. Uma aproximação muito utilizada para aumentar o fluxo de drogas através da pele é o uso de aumentadores de permeação, agentes químicos que interagem com os constituintes da pele, fluidizando ou extraindo seus componentes lipídicos, promovendo um temporário e reversível aumento de sua permeabilidade. Existe uma variedade de agentes químicos com capacidade de aumentar a constante de permeabilidade da pele em até 100 vezes, isto será comentado mais adiante. Uma mistura de água/etanol pode ser considerada como aumentadora da permeação, sendo comumente usada em indústrias químicas e farmacêuticas. É sabido da literatura que esta mistura produz um aumento do fluxo de uma variedade de drogas através da pele, porém pouco se sabe a respeito de seu efeito provocado nos constituintes do EC proporcionando este aumento da permeabilidade.

No presente estudo investigaremos estes efeitos utilizando uma poderosa ferramenta muito conhecida pelos físicos e biofísicos nas análises de membranas biológicas, a Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) de marcadores de spin, a qual nos possibilita verificar diversas características do sistema biológico em questão.

Preparação das Membranas de EC

As amostras de EC foram obtidas de ratos recém nascidos, menos de 24 h de idade, da raça Wistar. Após o sacrifício, as peles foram cortadas e suas gorduras removidas e colocadas em água destilada, em seguida foram colocadas sob vácuo num dessecador contendo 0,5 litro de hidróxido de amônio e posteriormente flutuando em água destilada com o lado interno em contato com a água.  Passado 2 h friccionamos o EC, a fim de remover as camadas mais internas da pele e então lavadas com água destilada para posteriormente serem colocadas para secar em condição ambiente. Por fim, as membranas foram postas sob vácuo em um dessecador contendo sílica gel, permanecendo ali até o uso.

Marcação das Amostras de EC

As membranas de EC desidratado foram cortadas em pedaços de aproximadamente 3 mg, em seguida colocadas por um período de 24 h mergulhadas em N-etil maleimido (NEM). Os marcadores, 5- e 16-doxil ácido steárico (5-, 16-DSA) , 5- e 16-doxyl methyl stearate (5-, 16-DMS), além do marcador análogo do colesterol, 5α-Androstano, todos contendo um anel do radical nitróxido, foram adquiridos da Sigma Chem. Co. (St Luis, MO). Uma pequena alíquota (0,5 μL) dos marcadores, dissolvido em solução de etanol (5 mg/mL), foram então aplicados sobre cinco placas de petri. Após colocamos as membranas úmidas nas placas, a fim de assegurar a marcação do EC, repetidas passagens das membranas sobre as placas foram efetuadas. Feito isso, as amostras marcadas foram suspensas em 100 μL de solução contendo tampão salino acetato (10 mM acetato, pH 5.1) e a requerida porcentagem de etanol (0–70%, v/v). As amostras permaneceram nesta solução por um período de 1,5 - 2 h, para que o EC pudesse ser submetido aos efeitos do etanol. Em seguida introduzimos o EC ainda úmido dentro de tubos capilares que fechados foram levados para as medidas de RPE.

Medidas do Teor de Solvente nas Amostras de EC

As medidas de hidratação do EC nas soluções foram realizadas separadamente a fim de verificar o teor de etanol presente nas membranas hidratadas. O procedimento foi análogo ao seguido para a marcação do EC, então pesamos as membranas umedecidas pela solução (EC + solvente) e em seguida as levamos para o dessecador por 48 h, restabelecendo o seu peso antes da hidratação. Pesamos então as membranas desidratadas e calculamos as percentagens de solvente (água/etanol) presente nas amostras.

Espectrômetro

O equipamento por nós utilizado foi um espectrômetro Bruker ESP300 equipado com uma cavidade ressonante ER4102 ST operando em banda X (~9.4 GHz). A análise dos espectros obtidos experimentalmente foi feita utilizando um programa denominado Non-Linear Least-Squares (NLLS), o qual permite realizar simulações espectrais a partir de dados experimentais, além da possibilidade de ajustar espectros com duas populações de marcadores com diferentes estados de mobilidade e em ambientes de polaridade diferentes.

Os espectros de RPE apresentaram duas componentes (1 e 2) nas amostras (0%) controle e uma terceira componente (3) nas amostras tratadas com etanol, indicando três populações distintas de marcadores no EC. Um modelo de três componentes utilizado na simulação dos dados de RPE descreveu satisfatoriamente os espectros experimentais, permitindo a determinação dos graus de mobilidade de cada componente separadamente, bem como suas populações relativas em função da concentração de etanol. Com o aumento da concentração de etanol pôde ser observada uma tendência, não significativa para um nível de significância de 5%, em aumentar a fluidez lipídica das bicamadas do EC e um aumento da quantidade de marcadores livres no solvente. Indicando que o etanol foi capaz de extrair os lipídios da membrana. O marcador 5a androstano é o que sai mais facilmente da membrana. O estearato de metila 5-DMS foi o de mais difícil extração dado o seu alto grau de hidrofobicidade e o marcador contendo o grupo carboxílico 5-DSA sofre um nível de extração intermediário.

O efeito observado mais importante foi o de extração dos lipídios da membrana por parte do solvente. Os dados obtidos com diferentes marcadores lipídicos indicaram que o marcador análogo do colesterol, 5a androstano, é o que sai mais facilmente da membrana. O estearato de metila 5-DMS foi o de mais difícil extração dado o seu alto grau de hidrofobicidade e o marcador contendo o grupo carboxílico 5-DSA sofre um nível de extração intermediário.