O potencial de ação clastogênica das drogas antitumorais tem sido bem demonstrado na literatura, embora pouco se sabe sobre os processos de reparo do DNA para drogas inibidoras de topoisomerase II, como o etoposido (VP16). O mecanismo de reparo das quebras de fita dupla (DSB: double strand breaks) induzidas por drogas dessa classe, envolve vias distintas das conhecidas para as radiações, embora possa compartilhar algumas vias comuns. A recombinação homóloga constitui uma das vias de reparo de DSBs causadas por inibidores de topoII, na qual são utilizadas como molde as seqüências homólogas das cromátides irmãs. Além dele, o reparo do tipo junção de extremidades não homólogas também pode estar envolvido. Entretanto, o grau de contribuição de cada um desses dois tipos de reparo, em resposta a essa classe de drogas, ainda necessita ser esclarecido, bem como a conexão entre as diferentes vias de sinalização que podem levar à morte ou à recuperação celular. Assim, para buscar uma melhor compreensão dos mecanismos de respostas celulares induzidas pelo antitumoral VP16 em células humanas, este trabalho objetivou avaliar respostas ao nível celular, citogenético e molecular, usando-se vários ensaios em células tratadas com a droga, em culturas de fibroblastos normais primários e em linfócitos de indivíduos normais.

A droga testada, etoposido (VP16), apresenta o nome comercial de Nex-Vep (Bristol-Myers Squibb), sendo a mesma classificada como um inibidor da enzima topoisomerase II, que atua pela estabilização de um complexo clivável. As células FHN (fibroblastos normais, primárias) e os linfócitos de sangue periférico humano foram tratados com o VP16 em diferentes concentrações e tempos, dependendo do experimento. Procederam-se várias análises: citotoxicidade e sobrevivência celular (Kit XTT), cinética do ciclo celular (citometria de fluxo), apoptose (coloração por fluorocromos), indução de trocas entre cromátides irmãs - SCEs (incorporação de bromo-deoxi-uridina e coloração por Giemsa) ensaio do cometa (Single Cell Gel Electrophoresis) e expressão transcricional (genes RAD17, ATM e BRCA1) por PCR quantitativa em tempo real. Neste, utilizou-se o kit contendo SYBR Green (Applied Byosystems), bem como iniciadores para os genes ACTβ, RAD17, BRCA1 e ATM; o método usado foi baseado em Livak & Schmittgen (Method. Methods 25: 402, 2001).

Nos testes de citotoxicidade e sobrevivência, foi observado que o agente VP16 (1 a 80 µM) em 96 horas de tratamento contínuo, induziu uma queda significativa na freqüência de sobrevivência dos fibroblastos, mas tal efeito citotóxico não foi demonstrado no período de 24 horas. Sob tratamentos com VP16, 5μM, os fibroblastos apresentaram um bloqueio acentuado na fase S do ciclo celular por até 48 horas, coincidindo com o tempo em que ocorreu maior freqüência de células apoptóticas, embora baixa, indicando que esse seja um tempo crítico para a sobrevivência das células tratadas com VP16, para que elas ativem a maquinaria de reparo em resposta ao dano e, após esse período, sinalizar para apoptose. Em contrapartida, em linfócitos, foram observados índices apoptóticos mais elevados, para 1 µM e 5 µM e esse fenômeno foi observado já nas primeiras 24h. O DNA nos linfócitos mostrou-se mais susceptível à quebra em relação aos fibroblastos; ainda, houve indução significativa de SCEs em linfócitos tratados e, como esse processo resulta de recombinação homóloga, foram analisados os níveis de expressão de alguns genes relacionados à percepção e reparo dos danos induzidos no DNA pelo etoposido. Verificou-se a indução do gene RAD17 e repressão do gene ATM, em linfócitos humanos e também do gene BRCA1, em fibroblastos, mostrando que esses genes estão envolvidos em vias contíguas de sinalização. De fato, muitos processos de monitoração e processamento do dano são dependentes da fosforilação da proteína BRCA1 pelo produto do ATM.

As análises realizadas ao nível celular, citogenético e molecular possibilitaram a obtenção de dados relevantes sobre os mecanismos de ação da droga antitumoral etoposido (VP16), visto que em conjunto, os resultados mostram a conexão entre os processos de indução de morte celular, controle do ciclo celular, reparo e sinalização dos danos induzidos no DNA, abrindo novas perspectivas de estudo. Por fim, sugerimos que possa existir uma via alternativa de sinalização de dano causado pelo etoposido, sendo esta independente do gene ATM, já que a fosforilação da proteína ATM parece ser dispensável para a fosforilação da RAD17, responsável pela ativação de vários genes reguladores da progressão e manutenção celular também dependentes da ativação prévia de produtos dos genes ATM e BRCA1 (Foray et al., Embo J. 22: 2860, 2003). Essa via alternativa seria a do gene ATR, conforme sugerido por Costanzo et al. (Mol. Cell. 11: 203, 2003) em ovos de Xenopus; este será analisado posteriormente, bem como outros genes participantes do reparo HR. Uma vez que o etoposido induz SCEs que, por sua vez, resultam de recombinação homóloga, a análise de genes da via HR será interessante.

Instituição de fomento: FAPESP (Proc. nº 03/13398-0, bolsa IC; Proc. 04/15611-6) e CNPq.

Trabalho de Iniciação Científica