A lectina KM+, extraída de sementes de Artocarpus integrifolia (jaca), é dotada de diversas propriedades biológicas relevantes, dentre elas a de estimular a produção de IL-12 por células apresentadoras de antígenos. Essa atividade confere ação imunomoduladora a KM+, evidenciada por indução de proteção contra infecção murina causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis e de camundongos BALB/c causada por Leishmania major. KM+ também possui ação cicatrizante aplicável no tratamento de queimaduras.

Uma vez que a lectina KM+ tem aplicações farmacêuticas, havia interesse no desenvolvimento de metodologias para obtenção dessa lectina em forma pura e em grandes quantidades. O cDNA codificador de KM+ foi isolado e então procedida a expressão heteróloga em Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae.

Realizaram-se diversos procedimentos para otimizar a produção heteróloga de KM+ em S. cerevisiae. As diversas tentativas de otimizar a produção heteróloga de KM+ criaram a necessidade de comparação entre as preparações obtidas, do ponto de vista quantitativo (concentração de KM+ recombinante) e qualitativo (atividade ligante de carboidrato de KM+ recombinante).

O presente trabalho teve como metas: desenvolver sistema de quantificação da proteína KM+ produzida em S. cerevisiae transformado; desenvolver sistema de avaliação da atividade lectínica das amostras de KM+ recombinante; aplicar tais métodos na identificação do sistema mais eficiente de expressão heteróloga de formas ativas de KM+.

Os ensaios realizados com anticorpos policlonais para capturar e revelar KM+ não foram satisfatórios, em função de sua baixa detectabilidade.

No segundo protocolo testado, os anticorpos monoclonais produzidos contra KM+ de jaca mostraram-se capazes de reconhecer a lectina produzida por S. cerevisiae. Dentre eles foi escolhido aquele que na reação com KM+ proporcionou maiores leituras de absorbância. A utilização de peroxidase para revelar a lectina capturada pelo anticorpo foi bem sucedida, já que ela foi capaz de ligar-se a KM+ e de manter sua atividade catalítica sobre o substrato H₂O₂. A aplicação de concentrações crescentes de KM+ de S. cerevisiae proporcionou absorbâncias crescentes e curva dose resposta logarítmica. Os pontos da região mais sensível da curva permitiram a construção de reta de calibração, cujo coeficiente de regressão foi de 0,99. O ensaio padronizado mostrou-se dotado de alta detectabilidade (0,030 a 0,125μg de KM+). Como vantagem adicional e relevante, ele quantificou apenas moléculas com atividade lectínica preservada, visto que a ligação a peroxidase ocorre por reconhecimento de suas glicanas.

A aplicação do ensaio para quantificar KM+ de amostras de S. cerevisiae transformado permitiu que se identificassem as condições ideais de expressão heteróloga de moléculas de atividade preservada. O maior rendimento de KM+ ativa foi proporcionado pela cepa BJ3501 (46μg/ml), cerca de 2 vezes superior ao maior rendimento proporcionado pela cepa INVSc1 (26μg/ml).

O ensaio de melhor desempenho para quantificar KM+ expressa por S. cerevisiae consiste de um sistema imuno-lectino-enzimático no qual anticorpo monoclonal específico captura KM+ e peroxidase a revela. Nesse ensaio, peroxidase exerce dupla função: é alvo de reconhecimento pela lectina e degrada o substrato peróxido de hidrogênio, resultando em desenvolvimento de cor. O ensaio permite que preparações de S. cerevisiae contendo KM+ sejam caracterizadas quantitativa e qualitativamente, visto que detecta apenas as moléculas que têm preservada a capacidade de reconhecer carboidrato.

O ensaio de quantificação realizado revelou diferenças na concentração de KM+ entre as diversas amostras provenientes de levedura testadas, destacando-se o rendimento obtido com a cepa BJ3501 de S. cerevisiae, cerca de 2 vezes maior que o maior rendimento obtido para os testes com a cepa INVSc1. Assim, os testes de otimização da expressão heteróloga de KM+ em S. cerevisiae podem ter prosseguimento, estando garantida metodologia adequada para quantificar e caracterizar a atividade ligante de carboidrato das proteínas recombinantes derivadas de diferentes sistemas de expressão.