A capacidade de glicose-frutose oxidorredutase (GFOR) e glucono-d -lactonase (GL), enzimas periplasmáticas de Zymomonas mobilis, de catalisar a bioconversão de glicose e frutose em ácido glucônico e sorbitol é conhecida há alguns anos. Entretanto, como estes produtos são formados equimolarmente, e a demanda comercial de sorbitol é superior à do ácido glucônico, a aplicação prática do processo é inviável. Estudos prévios relatam a possibilidade da oxidação de outras aldoses para a produção de ácidos orgânicos por GFOR/GL. Destaque-se, no caso, a formação de ácido lactobiônico, pela oxidação de lactose, que devido ao seu alto valor agregado, contribuiria para um balanço de produção compatível com a demanda comercial do sorbitol. Quanto às aplicações, sorbitol e ácido glucônico são utilizados na indústria farmacêutica e de alimentos e o ácido lactobiônico tem aplicações relevantes na área médica e cosmética. Neste contexto, a ação enzimática do complexo GFOR/GL, presente em células de Z. mobilis, foi caracterizado para os pares frutose/glicose e frutose/lactose – em relação aos efeitos do pH, temperatura, concentração de substratos – analisando-se, ainda, a cinética enzimática para cada par de substratos. Posteriormente, foi avaliada a produção de sorbitol e ácidos glucônico e lactobiônico por células de Z. mobilis livres e imobilizadas em alginato de cálcio, buscando, no segundo caso, o reaproveitamento das células em bioconversões sucessivas.

Z. mobilis ATCC29191foi cultivada em biorreator de 4,5L, em meio com 150g/L de glicose, a 30°C e pH 5,5. Após o cultivo, as células foram centrifugadas e permeabilizadas com CTAB. A atividade enzimática, expressa em unidades de GFOR/GL (U) por grama de biomassa seca, foi determinada por titulação automática com NaOH 1N, durante reação em 100mL de solução 0,7M de frutose/aldose e 4g/L de células permeabilizadas, sob agitação magnética. Uma unidade enzimática foi definida como mmol de ácido orgânico produzido por hora, nestas condições. Foram determinados os valores ideais de pH (5,2 a 7,2) e temperatura (37 a 54°C) que proporcionassem a maior atividade em soluções com 0,7M frutose/glicose (FG) ou frutose/lactose (FL). A termoestabilidade foi avaliada, por até 12h, a 39, 43 e 45°C. Os parâmetros cinéticos (K_m e V_m) foram calculados a partir das curvas de concentração de substratos (0,05 a 1,6M - FL; 0,05 a 2,5M - FG). Para a imobilização celular, uma mistura contendo iguais volumes da suspensão celular (50g/L) e alginato de sódio (4%p/v) foi gotejada em CaCl₂0,3M. Tanto a suspensão celular como as esferas de alginato de cálcio foram tratadas com glutaraldeído 0,5%(p/v) por 10 minutos. Os ensaios de bioprodução de sorbitol e ácidos glucônico/lactobiônico foram conduzidos em reator contendo 240mL de solução 0,7M de frutose/aldose, 25g/L de células livres ou 28g/L de células imobilizadas, sob agitação magnética, a 39°C e pH controlado automaticamente em 6,4 com NaOH 7M.

O pH ideal para a atividade de GFOR/GL situou-se em torno de 6,4, tanto para frutose/glicose (FG) como para frutose/lactose (FL), com atividade de 26 e 5U/g, respectivamente. Quanto à temperatura, atividades superiores foram alcançadas a 45°C para FG (36U/g) e entre 43-45°C para FL (7,5U/g). Nos testes de termoestabilidade, observou-se a manutenção da atividade próxima à máxima por 12h a 39°C, temperatura utilizada nos processos de bioconversão. Com os valores ótimos de pH e temperatura estabelecidos, o efeito de diferentes concentrações equimolares de frutose/aldoses foram testados. Como esperado, maior afinidade do complexo enzimático foi medida com o par FG, atingindo atividades superiores, cerca de 35U/g, entre 1,1 e 2M de substratos, com valores de K_m e V_m de 0,68M e 52U/g. Para FL, atividades enzimáticas crescentes foram medidas até 1,2M (12U/g), sendo que, nas condições avaliadas, não foi possível definir os parâmetros K_m e V_m pois os dados experimentais obtidos não seguiram o modelo clássico de Michaelis-Menten. As máximas velocidades específicas de formação de ácido glucônico ou lactobiônico, medidas nas primeiras horas de processo, foram 19,6mmol/g/h e 6,5mmol/g/h e de 2,5 e 0,75mmol/g/h, com células livres e imobilizadas, respectivamente. Rendimentos semelhantes para ácido lactobiônico e glucônico (80 e 90%, respectivamente) foram atingidos, tanto com células livres como imobilizadas.

Como esperado, maior velocidade de bioconversão foi alcançada com utilização de frutose/glicose, devido à alta especificidade da enzima pelo substrato glicose. Entretanto, apesar dos resultados inferiores obtidos para o par frutose/lactose, é evidente a necessidade do aprofundamento de estudos sobre a produção biotecnológica do ácido lactobiônico, em virtude de seu alto valor agregado e das suas importantes aplicações na área médica, já que este produto é utilizado como componente de solução de armazenamento de órgãos a serem transplantados, e na área de cosméticos, em razão de seu alto poder antioxidante. A utilização de células imobilizadas no processo de bioconversão é vantajosa pois as células podem ser reutilizadas em vários ciclos sem perda significativa de produtividade, facilitando, ainda, a separação dos produtos reacionais. Por outro lado, é preciso que sejam definidos novos biorreatores específicos para a condução do processo com células imobilizadas em maior escala.