O chumbo é um metal tóxico, de ocorrência natural, cuja exposição afeta diversos sistemas orgânicos, especialmente o hematológico, alterando a atividade de enzimas da biosíntese do heme. Uma destas enzimas, a ácido delta-aminolevulínico desidratase (ALAD) é utilizada como indicador de efeito na avaliação da exposição. A ALAD é codificada por um único gene do cromossomo 9q34 e possui dois alelos co-dominantes: 1 e 2, formando três genótipos: 1-1, 1-2 e 2-2. A diferença entre os polipeptídeos codificados pelos alelos 1 e 2 está na substituição da lisina pela asparagina no resíduo 59, resultante da troca das bases nitrogenadas guanina por citosina na posição 177 do gene. Esta mutação cria um sítio de restrição Msp I apenas no alelo 2, formando um polimorfismo, que gera três isoenzimas de cargas distintas, com diferentes afinidades de ligação ao chumbo. Tal diferença interfere no comportamento toxicocinético do metal. O objetivo deste trabalho consiste da preparação de amostras de DNA genômico humano para a determinação do polimorfismo da ALAD tendo como metas a otimização e padronização das metodologias de extração de DNA e de amplificação do fragmento polimórfico sem o uso de kits. A metodologia padronizada foi aplicada em uma amostra populacional constituída de crianças de 0 a 16 anos das comunidades do Complexo de Manguinhos-RJ, onde também avaliou-se a exposição ao chumbo.

A genotipagem da ALAD foi efetuada através do método desenvolvido por Wetmur et al (1991) e modificado por Mitri (2003), em quatro etapas: extração de DNA; amplificação do fragmento polimórfico do gene da enzima; incubação com a enzima de restrição Msp I e revelação do genótipo da ALAD. Na padronização da etapa de extração de DNA genômico humano foram testados dois métodos: o de Lahiri & Nurnberger (1991) e o de Fambroock & Ruffel (2001). A amplificação foi realizada através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), testando-se o tempo de cada etapa; a temperatura de anelamento, a quantidade de molde de DNA e a quantidade de Taq DNA polimerase. As amostras amplificadas foram tratadas overnight com a enzima de restrição Msp I a temperatura de 37°C. A reação de digestão foi paralisada com o uso de EDTA 0,5 mol/L a 65°C por 5 min. A revelação do genótipo foi feita através de eletroforese em gel de agarose (0,9%), utilizando-se como padrão DNA de fago lambda digerido com a enzima de restrição Ava II e visualizada em 302 nm no UV. A população alvo do estudo foi selecionada seguindo critérios como morar na residência há no mínimo três meses, ter entre 0-16 anos e não possuir doença debilitante. Os indicadores de exposição avaliados foram: recuperação de ALAD (%), chumbo em sangue e urina (Pb-S e Pb-U), ALA urinário e zincoprotoporfirina. Foi aplicado um questionário sócio demográfico e de freqüência alimentar. Este projeto foi aprovado pelo CEP ENSP/FIOCRUZ.

As metodologias das etapas de extração de DNA e de amplificação do fragmento polimórfico foram otimizadas e padronizadas sem a utilização de kits. O método de extração de DNA genômico humano, selecionado para a genotipagem da ALAD, foi o de Fambroock & Ruffel (2001), devido ao uso de menor volume inicial de sangue (600mL) apresentando um rendimento entre 10-15mg/100mL. A etapa de PCR foi padronizada com 40 ciclos a 95°C por 2min (desnaturação); 62°C por 15 seg (anelamento); 72°C por 2min (extensão); 50ng de molde de DNA e 1,5U de Taq DNA polimerase. A metodologia de genotipagem da ALAD otimizada e padronizada foi aplicada na amostra populacional constituída por 40 crianças, a qual apresentou freqüência alélica de 0,95 para o alelo 1 e 0,05 para o alelo 2. Em relação à freqüência genotípica, os resultados foram de 0,9 para ALAD^1-1 e 0,0045 para ALAD^1-2, não sendo encontrados homozigotos ALAD^2-2. Embora o tamanho desta população seja inadequado para aplicação de cálculos de freqüências genéticas, os resultados obtidos concordam com a literatura, que relata freqüências alélicas de 0,9 e de 0,1 para os alelos 1 e 2 respectivamente. A avaliação da exposição desta população demonstrou que 5% das crianças estavam com níveis de chumbo em sangue acima de 10 μg/dL, o que caracteriza uma exposição significativa ao metal.

O objetivo deste trabalho, que consistiu da preparação de amostras de DNA genômico humano para a determinação do polimorfismo da ALAD foi alcançado, obtendo-se uma metodologia para a genotipagem da ALAD específica, sensível e adequada para aplicação em amostras populacionais, sem a utilização de kits. Com a aplicação da metodologia estabelecida foi possível realizar a genotipagem das crianças em ALAD^1-1 e ALAD^1-2, não tendo sido encontrado o genótipo ALAD^2-2. Os resultados obtidos estão de acordo com dados encontrados na literatura e representam mais um fator de risco para esta população, na qual 5% das crianças apresentavam níveis de Pb-S acima do recomendado. Este novo modelo biológico deve ser utilizado como um indicador de susceptibilidade em conjunto com os outros indicadores de exposição.