Os leucócitos polimorfonucleares (PMN) ou neutrófilos desempenham papel essencial na resposta imune inata. Para proteger o hospedeiro, os PMNs possuem um arsenal microbicida contra agentes invasores incluindo a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), e liberação de enzimas proteolíticas (desgranulação). Durante a ativação de neutrófilos muitas EROs são geradas pela enzima mieloperoxidase (MPO). Além disso, os grânulos citoplasmáticos dos PMNs contêm enzimas proteolíticas, dentre as quais a elastase apresenta um grande potencial no sentido de promover destruição tecidual em doenças inflamatórias crônicas ( ex. artrite reumatóide, lupus, psoríase, etc ).

Segundo a literatura, os PMN podem ser utilizados como complexos alvos no "screening" de extratos de plantas ou compostos isolados de fontes naturais para avaliar o seu potencial anti-inflamatório, através da avaliação da atividade(s) inibitória(s) de diversas funções neutrofílicas. Estas funções (produção de EROs; desgranulação) estão envolvidas na fisiopatologia de muitas doenças e, portanto, a modulação destas é de interesse estratégico no controle de diversas condições inflamatórias não-infecciosas mediadas por PMNs.

Este trabalho teve como objetivo desenvolver um bioensaio multi-alvo da enzima MPO que permita avaliar a atividade de produtos naturais na produção de EROs e um bioensaio com a enzima elastase neutrofílica humana para avaliar o efeito de compostos sobre a desgranulação de PMN.

  2.1 Isolamento de PMN: O sangue foi colhido por punção venosa de indivíduos saudáveis utilizando-se heparina de sódio como anticoagulante seguindo o protocolo estabelecido de acordo com as normas éticas vigentes.

     2.2.1 Obtenção da MPO: Os neutrófilos suspensos foram submetidos a ciclos de congelamento e descongelamento em freezer -70°C. O lisado foi centrifugado a 2.000 x g durante 6 min.

     2.2.2 Ensaio da enzima MPO: Avaliou-se a atividade da MPO através do ensaio de quimioluminescência dependente de luminol: 10μL de luminol (280μmol/L), 50μL do lisado 50μL, 200μL de H2O2 (5mmol/L) e 10μL do composto analisado ou 10μL de DMSO (controle). Realizo-se a leitura da QLlum produzida, em Luminômetro Autolumat LB953 (EG&G Berthold), durante 20 minutos a 37 ºC.
    
     2.3 Ensaio de Desgranulação: Alíquotas de 180μL contendo 2x105 PMNs foram adicionadas em microplaca. A cada poço da placa foram adicionados 10 μL de solução de citocalasina B (concentração final de 1,0µmol/L). Ao controle negativo adicionou-se 10μL de Hanks. Agitou-se a placa e aguardou-se 10 minutos. Em seguida adicionou-se 10μL de fMLP preparado ao controle positivo (concentração final de 1µmol/L) e 10μL de hanks ao controle negativo. Após 30 minutos, adicionou-se 50μL do oligopeptídeo SAAVNA(1mM). Realizou-se leituras em espectrofotômetro em 405nm a cada 10 minutos, sendo que os resultados que foram avaliados foram aqueles obtidos após 1 hora de reação.

Os ensaios das enzimas mieloperoxidase e elastase foram padronizados e avaliou-se a atividade dos flavonóides quercetina, miricetina, galangina e kaempferol sobre a produção de EROs, bem como o efeito da quercetina sobre a desgranulação.

Os resultados mostram a seguinte ordem de atividade biológica sobre o sistema padronizado com a MPO: galangina < kaempferol < quercetina = miricetina. Observa-se que todos os compostos testados apresentam uma considerável atividade antioxidante e “scavenger” nas concentrações e condições experimentais empregadas. De acordo co a literatura, a quercetina e a miricetina tiveram um efeito mais expressivo em virtude de apresentarem um maior número de hidroxilas no anel B.

            Um aspecto importante que deve ser levado em consideração é a possibilidade de os flavonóides estarem atuando diretamente sobre a enzima MPO, inativando-a. Tal fato também causaria a inibição da QLlum de forma dependente da concentração dos compostos.

            Os resultados também evidenciaram que a quercetina apresentou um efeito inibitório sobre a desgranulação de PMNs mesmo em baixas concentrações. Possíveis efeitos citotóxicos do flavonóide sobre essas células podem ser excluídos, considerando as concentrações testadas.