ESTUDO IN VITRO DOS EFEITOS CITOTÓXICOS E DA GLIOSE REACIONAL INDUZIDOS PELO ALCALÓIDE DEHIDROMONOCROTALINA.

A Crotalaria retusa, conhecida popularmente como Guizo-de-cascavel, pertence ao gênero Crotalaria da família Leguminosae. Relatos de intoxicações em animais e humanos por plantas deste gênero são descritos na literatura. A intoxicação ocorre quando animais ingerem a planta no período de escassez de alimentos ou pela ingestão acidental através da contaminação de grãos com sementes da Crotalaria. Plantas do gênero Crotalaria também são de grande interesse devido às perdas econômicas causadas por intoxicação do gado e à exposição da população humana, que utilizam muitas dessas plantas na medicina popular. Os Alcalóides pirrolizidínicos (AP) são a maior classe de toxinas derivadas de plantas. A monocrotalina é o principal AP encontrado em plantas do gênero Crotalaria, sendo a dehidromonocrotalina (DHMC) seu principal metabólito ativo. No sistema nervoso central (SNC) as células gliais, e em especial os astrócitos, estão envolvidas, dentre outras funções, nos fenômenos de detoxificação e manutenção da homeostasia. Após danos no SNC, os astrócitos reagem principalmente com proliferação, hiperplasia, acúmulo de glicogênio e desenvolvimento de fibrose pelo aumento da expressão da proteína ácida do gliofilamento (GFAP), sendo este fenômeno conhecido como astrogliose. Este trabalho objetivou investigar as propriedades citotóxicas da DHMC, sobre células gliais, em termos de viabilidade, proliferação e diferenciação celular.

Culturas primárias de astrócitos foram obtidas a partir do córtex cerebral de ratos Wistar neonatos (0-2 dias), de acordo com o método descrito por Letourvel e colaboradores (1994). Os efeitos da DHMC foram investigados por um período de 72h, e nas concentrações de 0,1-500 µM; células tratadas com o veículo de diluição da DHMC (0.5% DMF) foram adotadas como controle. A citotoxicidade foi avaliada através do teste do MTT, de acordo com Hansen e colaboradores, (1989): após tratamento, as células foram incubadas por 2h com o MTT (1mg/mL, Sigma) e então lisadas com 20% SDS e 50% DMF (pH 4,7), e a densidade óptica medida a 560nm. A reatividade astroglial foi investigada através de marcação imunocitoquímica e western blot da GFAP. Após fixação com metanol (20 min, -20ºC), as células foram incubadas com anticorpos policlonais anti-GFAP (1/200, Biorad) e posteriormente com anticorpos anti-IgG de coelho conjugados à rodamina (1/500, Boeringer). Para o western blot, 5µg de proteínas foram submetidas a eletroforese (SDS-PAGE), transferidas para membranas de PVDF (Millipore) e, após o bloqueio (0,5% BSA), as membranas foram incubas com anticorpos policlonais anti-GFAP (1/10.000, Biorad) e em seguida com anticorpos anti-IgG de coelho (1/5.000, Biorad) conjugados à fosfatase alcalina. Bandas imunorreativas foram visualizadas usando o substrato do kit Protoblot II AP System.

A citotoxicidade da DHMC aos astrócitos foi avaliada pela medida da atividade das desidrogenases mitocondriais através do teste do MTT. Os resultados foram comparados através do Teste t- de Student, sendo considerados significantes valores com P<0,05. Esta análise revelou que em relação ao controle (1% DMF), a DHMC na mais baixa concentração adotada (0,1mM), não interferiu significativamente na viabilidade dos astrócitos após 24 h de tratamento. Por outro lado este teste revelou que houve uma redução significativa da viabilidade celular nas demais concentrações adotadas (1-500mM). Ainda, após 72h de exposição, foi observado que a DHMC induziu uma diminuição significativa da viabilidade celular em todas as concentrações testadas quando comparadas ao controle, entretanto não houve evidência de um efeito dose-resposta. Modificações na expressão da GFAP foram verificadas por imunocitoquímica e por Western-blot e variaram segundo a dose adotada: desde 24h de tratamento, 0,1-1 mM DHMC induziram nos astrócitos um aumento na expressão de GFAP e as células apresentaram um aumento qualitativo da marcação da GFAP, caracterizado pelo aumento do corpo celular e uma forte tendência em formar processos; por outro lado, 10-500 mM DHMC induziram uma redução na expressão de GFAP e as células apresentaram uma marcação fraca desta proteína, mais restrita à região peri-nuclear e aos processos celulares, quando presentes.

A MCT e seu metabólito ativo DHMC, são descritos como alcalóides primariamente hepatotóxicos, entretanto, animais mais sensíveis à intoxicação, podem apresentar sinais clínicos nervosos normalmente associados a um quadro de encefalopatia hepática. Ainda, mais recentemente, foi demonstrado um comprometimento de astrócitos no núcleo caudato e no córtex de equídeos intoxicados com Crotalaria retusa, sendo evidenciado uma hiperplasia e formação de núcleos vesiculares nessas células. Vários estudos para melhor compreensão dos efeitos da MCT e seus metabólitos têm sido realizados, entretanto, não se sabe se estas moléculas podem exercer um efeito direto sobre células do SNC durante a patogênese da intoxicação. Neste estudo os resultados obtidos demonstraram claramente que a DHMC tem ação direta sobre astrócitos corticais de ratos, que reagem de forma heterogênea em função da concentração da DHMC a que são expostos, seja através de modificações que sugerem uma astrogliose, seja com perda da viabilidade, quando fenômenos de citotoxicidade são desencadeados e podem estar conduzindo estas células para a morte. Estudos complementares, no entanto, deverão ser desenvolvidos para esclarecer sobre como estes efeitos são desencadeados em astrócitos e sua possível relação com os danos no SNC.