Nas regiões produtoras tradicionais assim como nas regiões onde a cultura tem sido introduzida, a pupunheira (Bactris gasipaes) é afetada por várias doenças parasitárias. A podridão da base da estirpe da pupunheira é uma doença importante na região Litoral do Paraná, sendo o agente causal da doença identificado como Phytophthora spp. O gênero Phytophthora contém aproximadamente 60 espécies e inclui espécies patogênicas à diversas espécies de plantas. A identificação de espécies de Phytophthora de acordo com a taxonomia clássica está baseada em características culturais e morfológicas do patógeno, sendo uma tarefa difícil e geralmente requer a colaboração de especialistas em taxonomia do gênero. Recentemente, técnicas moleculares baseadas no emprego da reação da polimerase em cadeia (PCR), têm facilitado a identificação de espécies assim como estudos de relacionamento filogenético entre espécies deste e de outros grupos de fungos. O objetivo do trabalho foi otimizar o protocolo de extração e obter o isolamento de DNA genômico de quatro isolados de Phytophthora patogênicos à pupunheira obtidos no Paraná, e obter a amplificação por PCR de um segmento da região ITS do DNA ribossômico dos isolados.

Foram obtidos quatro isolados de Phytophthora patogênicos à pupunheira, procedentes de plantios localizados no Litoral do Paraná. As culturas puras dos isolados foram obtidas através de pontas de hifas. Para obtenção de massa micelial visando a extração de DNA, os isolados foram cultivados em meio líquido de cenoura por sete dias a 18 °C. A massa micelial foi separada do meio liquido através de filtração com gaze esterilizada, transferida para tubos Eppendorf e armazenada a –20°C. Posteriormente foi realizada a extração do DNA genômico dos isolados com base no protocolo de Wangsomboondee e Ristaino (2002. Plant Disease 86: 247-253). A qualidade do DNA das amostras foi avaliada através da corrida em gel de agarose 1%. O DNA extraído foi utilizado na reação de PCR visando à amplificação de um segmento de DNA ribossômico, contendo o gene 5.8S e as regiões ITS1 e ITS2. As reações de amplificação foram conduzidas em um termociclador Tpersonal Whatman Biometra. Inicialmente foram utilizados os primers ITS4 e ITS5, os quais resultaram em segmentos de DNA muito grandes, sendo assim foram utilizados novos pares de primers, ITS2 e ITS3. A reação de PCR foi baseada em 35 ciclos, sendo 1 min a 94°C; 30 seg a 55°C; e 1 min a 72°C. Previamente aos ciclos , as amostras foram submetidas a temperatura de 94°C por 1 min, e de um período extra de extensão de 5  min a 72°C após os 35 ciclos. Os produtos da reação de PCR foram visualizados em gel de agarose a 1,5%.

Através da reação da polimerase em cadeia (PCR) e com o emprego dos primers ITS4 e ITS5 foram amplificados segmentos de DNA ribossômico com aproximadamente 800 pares de bases, com os quais não foi possível obter-se o sequenciamento direto de DNA. Esse problema metodológico foi contornado com o emprego de primers que permitem a amplificação de segmentos menores do DNA ribossômico.  Assim, as reações de PCR com os pares de primers ITS5/ITS2 e ITS3/ITS4 foi possível à obtenção de segmentos de aproximadamente 300 e 600 pares de bases, respectivamente.

       As seqüências de DNA dos produtos de PCR dos segmentos de DNA ribossômico obtidos com os primers ITS5/ITS2 e ITS3/ITS4 foram comparadas com seqüências de DNA ribossômico de espécies de Phytophthora do GenBank (http: www.ncbi.nlm.nih.gov) o que permitiu a confirmação da identificação da espécie como P. palmivora. As seqüências de DNA dos isolados do Brasil apresentaram homologia superior a 90% em relação às seqüências de Phytophthora do GenBank.  Esses resultados confirmaram a identificação dos isolados que foi realizada por Santos et al. (2004. Fitopatologia Brasileira 29: 680-682) a qual foi baseada apenas em caracteres morfológicos.

            Os resultados deste trabalho contribuirão para um estudo mais aprofundado sobre as espécies de Phytophthora que afetam palmáceas e outros grupos de plantas cultivadas no Paraná.

Com este estudo foi obtido um protocolo otimizado para extração de DNA genômico de isolados de Phytophthora associados à podridão da base da estirpe da pupunheira, sendo os produtos desta extração utilizados na reação da polimerase em cadeia (PCR), onde foram amplificados segmentos do DNA ribossômico dos isolados compreendendo as regiões ITS1, ITS2 e 5.8S. Com base nestas seqüências, os isolados foram identificados como sendo da espécie Phytophthora palmivora.