Uma cópia do gene lexA de C. crescentus contendo uma deleção em fase foi obtida através de reações de PCR. As porções 5’ e 3’ do gene foram clonadas no vetor pGEM-T Easy (Promega) e seqüenciadas. Com auxílio dos sítios de restrição presentes nos primers, os fragmentos foram ligados e inseridos no vetor suicida para Caulobacter, pNPTS138 (cedido por M.R.K. Alley). Este vetor se insere no genoma através de recombinação homóloga; a seleção dos mutantes é então realizada através da resistência à canamicina e sensibilidade à sacarose, marcas fornecidas pelo plasmídeo.

Foram realizadas fusões transcricionais com o gene lacZ para análise da indução do promotor de lexA, utilizando o vetor pLacZI290. A região promotora de lexA foi obtida por reação de PCR e clonada neste plasmídeo; este foi, então, transferido para C. crescentus. As cepas portando essa construção foram irradiadas com diferentes doses de luz UV e após o período de recuperação, a atividade de beta-galactosidase foi medida.

Para a realização do ensaio de crescimento, as cepas mutante e selvagem cultivadas no dia anterior ao experimento foram diluídas até DO_600nm 0,1. A cada uma hora e trinta minutos eram coletadas alíquotas da cultura para aferição da DO_600nm e para plaqueamento em meio PYE.

A complementação da cepa nula para lexA foi realizada utilizando-se o vetor de poucas cópias pMR20. Neste vetor foi clonada a cópia selvagem do gene; esta construção foi então transferida para o mutante mencionado.

A análise da expressão do promotor de lexA através dos ensaios de atividade de beta-galactosidase revelou indução de cerca de três vezes deste após irradiação com luz UV, o que sugere, portanto, um importante papel do gene para a reparação de danos à molécula de DNA em C. crescentus.

O mutante para o gene lexA de C. crescentus é viável;  em E. coli não foi possível a obtenção de mutantes para esse gene devido à filamentação letal mediada por sulA.

O cepa contendo deleção em lexA apresenta crescimento reduzido se comparado àquele da cepa selvagem NA1000, tanto no que se refere à DO_600nm quanto às unidades formadoras de colônia. O gene lexA é, portanto, também importante para o desenvolvimento normal da célula.

A observação do mutante sob o microscópio ótico revelou aspecto filamentoso das células. Esse fenótipo é característico de cepas nulas para o gene lexA, uma vez que na ausência deste, SulA impede a polimerização do anel de FtsZ no septo divisional, impedindo a ocorrência da divisão celular. Esse é um importante checkpoint bacteriano, que promove uma conexão entre a reparação de danos no DNA e a progressão no ciclo celular. Uma vez que C. crescentus não apresenta homólogos de sulA, procuramos agora identificar qual o gene regulado por lexA que causa o bloqueio na divisão celular neste organismo.

A construção no vetor pMR20, quando transferida para C. crescentus, restaurou o fenótipo selvagem, validando, portanto, os resultados obtidos até então.

LexA é um gene central para a resposta SOS em C. crescentus. Sua deleção não se mostrou letal, mas o gene é necessário para o bom crescimento e desenvolvimento da célula. Conforme observado em outros organismos, também em C. crescentus a deleção de lexA impediu a ocorrência da divisão celular. Resta agora identificar qual o gene regulado por lexA que promove esse fenótipo.