| D. Ciências da Saúde - 4. Odontologia - 10. Odontologia |
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Estudos das isoenzimas da hexoquinase em glândulas salivares de ratos controles e diabéticos induzidos por estreptozotocina |
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| Jonas Alencar de Matos 1 |
| Fernando Neves Nogueira 1 |
| José Nicolau 1 |
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| (1. Departamento de Materiais Dentários, Faculdade de Odontologia, USP / ODM-FOUSP) |
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| INTRODUÇÃO: |
O metabolismo da glicose é de fundamental importância para os organismos vivos. A função da hexoquinase na regulação do metabolismo de carboidrato é bem conhecida e essencial para sua metabolização, sendo a primeira enzima a atuar sobre a glicose transformando-a em glicose-6-fosfato que é o principal substrato para as vias metabólicas.
Estudos preliminares realizados em nosso laboratório mostraram que o diabetes provoca uma redistribuição da hexoquinase e uma diminuição da atividade da enzima na fração solubilizada na glândula submandibular. Na glândula parótida foi observado em ambas as formas, solúvel e solubilizada, o aumento da atividade no estado diabético comparados ao grupo controle.
Nos mamíferos a família das hexoquinases apresentam-se em 4 formas isoenzimáticas (I, II, III, IV) que são distribuídas de formas distintas nos diferentes órgãos. Nas glândulas salivares (parótida e submandibular) de ratos é descrito na literatura a presença das isoenzimas tipo I e II, havendo o predomínio da isoenzima tipo I. Estudando as isoenzimas de glândulas salivares de ratos controles e diabéticos em nosso laboratório, foi levantada a suspeita de existir outra isoenzima nas glândulas de ambos os grupos. Essa isoenzima era liberada no líquido de lavagem durante a cromatografia em coluna de DEAE-celulose.
O objetivo foi estudar detalhadamente as isoenzimas de glândulas salivares de ratos caracterizando cada uma delas tanto em animais controles como em ratos diabéticos.
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| METODOLOGIA: |
Foram utilizados para o estudo ratos machos da raça Wistar (180 – 200g), mantidos em gaiolas com livre acesso a água e comida. Eles foram sacrificados e suas glândulas submandibulares foram removidas e imediatamente prensadas em lâminas de alumínio previamente esfriadas em gelo seco. Elas foram armazenadas em freezer -80oC para posterior análise.
A metodologia utilizada para a purificação das isoenzimas foi a cromatografia em coluna de DEAE-celulose, onde o homogenado da glândula foi passado na coluna, lavado e eluído em forma de gradiente linear (0-0,5M). Os líquidos de lavagem e eluição foram coletados após a passagem pela coluna de DEAE-celulose e foram analisados. Apesar de termos conseguido fazer a purificação por esse método, não foi possível fazer a determinação de cada uma das isoenzimas, por esse motivo e devido a maior precisão do HPLC (High Performance Liquid Chromatography) passamos a utiliza-lo para fazer as cromatografias usando uma coluna de troca iônica do tipo DEAE-5PW.
As glândulas submandibulares foram homogenadas, centrifugadas e o sobrenadante foi filtrado em filtro millipore com poro de 0,22 um para aplicação de 20 uL na coluna do HPLC.
Para se fazer a comparação das isoenzimas foi usado o homogenado de tecidos como fígado, coração, cérebro e músculo, porém não obtivemos sucesso. Por isso aplicamos a hexoquinase pura.
A atividade da hexoquinase foi medida pelo método de UYEDA & RACKER (1965) e proteína pelo método de Lowry et al. (1951).
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| RESULTADOS: |
Nos resultados obtidos em cromatografia de DEA-celulose, observamos a presença de picos de atividade da enzima tanto no líquido de lavagem quanto no líquido extraído da eluição. Na lavagem os primeiros tubos apresentam atividade, porém não há formação de picos e sim um platô, nos tubos seguintes há a presença de 2 picos bem nítidos. No líquido extraído da eluição encontramos 2 picos presentes no início que são bem nítidos, depois há uma diminuição gradativa da atividade da enzima e durante alguns tubos ocorre a estabilização da atividade que depois voltou a cair até cessar.
No HPLC verificamos que ao passar a hexoquinase pura obtivemos durante a lavagem a saída de impurezas e durante a eluição houve a presença de 2 picos bem visíveis que correspondem as isoenzimas presentes que o fabricante não informava quais eram. Ao passar o homogenado da glândula submandibular obtivemos a saída de impurezas durante a lavagem e na eluíção observamos alguns picos que quando comparados com os da hexoquinase pura verificamos que a liberação deles foi no mesmo momento.
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| CONCLUSÕES: |
Com os resultados obtidos até o momento foi possível identificar que tanto os obtidos no HPLC como na coluna de DEAE-celulose, há a presença de mais que 2 picos nos gráficos obtidos e o líquido de lavagem obtido da coluna de DEAE-celulose apresentou atividade. Ambos os fatos fortalecem nossa suspeita de que pode haver mais uma outra isoenzima da hexoquinase em glândulas salivares de ratos.
Não foi possível chegar a um resultado conclusivo sobre a presença de uma terceira isoenzima em glândulas de ratos, porém há fortes indícios. Pretendemos continuar nossos estudos fazendo a aplicação separada das isoenzimas de hexoquinase pura e comparar com o homogenado da glândula submandibular, já que vimos ser possível fazer essa comparação.
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Instituição de fomento: CNPq
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Trabalho de Iniciação Científica
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Palavras-chave: diabetes mellitus; hexoquinase; isoenzimas. |
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| Anais da 58ª Reunião Anual da SBPC - Florianópolis, SC - Julho/2006 |