Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti), bactéria anaeróbia facultativa, é amplamente utilizada na produção de bioinseticidas devido à sua capacidade de sintetizar um cristal protéico, concomitantemente à esporulação, que é altamente tóxico contra larvas de simulídeos, culicídeos e outros dípteros de importância para a saúde pública. Bioinseticidas à base de Bti possuem uma alta especificidade contra o inseto alvo, o que lhes confere uma vantagem sobre os inseticidas químicos. Por outro lado, os bioinseticidas apresentam como desvantagem, o alto custo do produto, uma vez que a maioria das formulações empregadas é importada. Por este motivo, para redução do custo do meio de produção, são geralmente empregados resíduos agroindustriais como farelo de soja, cevada, levedo de cerveja e sementes de leguminosas, como fontes de nitrogênio, e melaço e soro de queijo, como fontes de carbono. Entretanto, estes componentes podem gerar dificuldades na condução do processo, devido à parcial ou total insolubilidade destes no meio de cultivo. As exigências nutricionais para o crescimento de Bti são relativamente simples, necessitando de fontes de carbono para a produção de energia e fontes de nitrogênio para síntese de biomassa e esporulação. Neste contexto, este trabalho visou o estudo do cultivo de Bti em meios contendo fontes de carbono e nitrogênio orgânico economicamente aplicáveis a maiores escalas.

As fontes de carbono testadas, nas concentrações de 5, 10 e 20g/L, foram glicose (G5, G10 e G20), lactose (L5, L10 e L20) e sacarose (S5, S10 e S20), adicionados aos meios contendo extrato de levedura e sais, em comparação a um meio sem fonte de carbono (SC). Estes ensaios foram conduzidos em agitador de bancada (Certomat U – B. Braun Biotech) a 130rpm e 30°C, por 48h. As concentrações de substrato foram determinadas pelo método do DNS, com hidrólise ácida prévia no caso da sacarose, e as de biomassa celular pela absorbância (até 6 h de cultivo) e, ao final do cultivo, por gravimetria. A esporulação foi determinada por contagem em placas de Petri. Em biorreator de bancada de 4L (Biostat B, B. Braun Biotech), testaram-se as fontes de nitrogênio orgânico extrato de levedura bruto (ELB, 12g/L), farelo de soja (FS10, 15 e 20g/L) e extrato de soja em pó desengordurado (PS 8,4 e 12g/L), em meio com 20-25g/L de glicose e sais. Os cultivos foram conduzidos a 30°C, com o pH controlado entre 5,5-7,0 com adição de KOH 5M e HCl 2N e o oxigênio mantido em concentração mínima de 30% da saturação. Nos ensaios em biorreator, a concentração celular foi estimada indiretamente a partir da demanda de oxigênio pelo cultivo (OUR), calculada com o auxílio de um oxímetro

Nos testes com fontes de carbono, após 24h, foram medidas os seguintes concentrações de biomassa, em g/L: 2,9 (SC), 4,6 (G5), 7,5 (G10), 10,8 (G20), 1,7 (L5), 3,3 (L10), 4,6 (L20), 4,4 (S5), 4,6 (S10) e 6,7 (S20). Apesar desta diferença, taxas de esporulação da ordem de 10¹⁰ esporos/mL foram alcançadas, em 36h, em qualquer condição. A utilização de substrato foi total em meios contendo glicose. Nos meios contendo sacarose, houve um baixo consumo de açúcar, com altos valores residuais ao final do cultivo. Com lactose, o consumo do substrato foi ainda menor. Em biorreator de bancada, a concentração celular máxima nos cultivos com diferentes fontes de nitrogênio orgânico foi de 11,5, 11,0, 10,3 e 13,8g/L para ELB12, FS20, PS8,4 e PS12, respectivamente. O perfil de consumo de substrato foi proporcional ao crescimento celular em todas as condições testadas. Nos cultivos ELB12, FS20 e PS8,4 e PS12, foram obtidos 3,3x10¹², 4x10¹², 4x10¹³ e 1,2x10¹¹ esporos/mL, respectivamente. Um perfil diferente de cultivo foi observado com os meios FS10 e FS15, mostrando crescimento diáuxico devido à limitação da fonte de nitrogênio e à posterior lise celular que teria reposto o nitrogênio no meio. Duas fases exponenciais de crescimento foram notadas, 4 a 9h e 12 a 15h, no cultivo FS10, e de 4 a 9h e 11 a 22h, no FS15, com biomassa celular de 5,1 e 8,4 g/L e 5,8 e 12g/L, respectivamente. Na esporulação, obtiveram-se 5,9x10¹² e 6,2x10¹² esporos/mL com FS10 e FS15, em 28 e 30h, respectivamente.

A fonte de carbono utilizada no meio de cultivo mostrou influência direta sobre o crescimento celular, embora este efeito não tenha sido observado na esporulação, que, nas condições testadas, mostrou resultados semelhantes em meios com ou sem a presença de carboidratos. Os resultados confirmam relatos da literatura que sugerem que Bti cresce diretamente a partir da fonte protéica, enquanto a fonte de carbono funciona apenas como substrato energético. Com relação aos meios contendo diferentes fontes de nitrogênio orgânico, pôde-se observar variações tanto nos valores de concentração celular como de esporulação. Todas as condições testadas apresentaram altos valores de esporulação. Entretanto, os meios contendo extrato de levedura bruto, de custo relativamente baixo, foram considerados mais adequados pelo fato de não conterem sólidos em suspensão, como o farelo de soja, ou não interferirem na viscosidade, como o extrato de soja, o que facilitaria a condução do processo em maiores escalas. Os estudos indicam a necessidade de estabelecer-se uma correta correlação entre fontes de carbono e nitrogênio orgânico nestes meios.