O bicho-da-seda Bombyx mori é um inseto de importância econômica principalmente para o Estado do Paraná, o qual produziu na safra 2004/2005 89% dos casulos verdes comercializados pelo Brasil. A COCAMAR - Cooperativa Agroindustrial, sediada em Maringá-PR, possui um acervo biológico com 16 matrizes de origens japonesa e chinesa de B. mori. A origem diversificada deste acervo é importante, pois as matrizes japonesas apresentam casulo com alto teor de seda, e as matrizes chinesas apresentam uma maior resistência ao cultivo no campo. Desta forma, para obtenção de híbridos de alto valor comercial, que apresentem elevado rendimento de casulos por grama de ovos e uma alta qualidade dos fios da seda, procura-se selecionar as características genéticas das matrizes japonesas e chinesas. A análise do DNA mitocondrial (mtDNA) tem sido amplamente utilizada em estudos genéticos e filogenéticos de insetos devido ao seu caráter de herança maternal, sua abundância, estrutura gênica simples, pequeno tamanho e pela característica de um genoma com alta taxa evolucionária. Com o objetivo de reconstruir uma relação intraespecífica do acervo biológico armazenado na COCAMAR, analisamos a região não-codificadora denominada D-loop, que é rica em A + T, e que provavelmente possui o controle da replicação e da transcrição do mtDNA.

O banco de germoplama da COCAMAR é composto de 8 matrizes de origem japonesa, HA-A, HA-B, M18-2, M102, M19-2, J1, M11-A e M12-B, e 8 matrizes de origem chinesa, C209, C21-A, C14, C24-A, C24-2, C25-B, C121-A e C122-B. Lagartas na quinta idade de todas as matrizes foram dissecadas e as glândulas sericígenas armazenadas imediatamente em isopropanol a - 20°C. O DNA genômico foi extraído segundo Monesi et al., 1998, e a quantificação do DNA realizada através de eletroforese em gel de agarose a 0,7% com tampão TBE 1X (Tris-Borato), com padrão de tamanho molecular HindIII. A amplificação da região D-loop mitocondrial foi obtida através de PCR (Polymerase Chain Reaction) com primers específicos (5’-ATAACCGCAACTGCTGGCAC-3’ e 5’-TTGAGGTATGAGCCCAAAAGC-3’) que flanqueiam essa região em Bombyx mori (AF149768). As condições de amplificação foram: 10 min. 94°C, 1min. 94°C, 1 min. 58,8°C, 1 min. 72°C e extensão final de 10 min 10°C. O produto amplificado da matriz HA-A foi inserido em plasmídio pDrive (QIAGEN PCR Cloning Kit) e seqüenciado em MegaBACE 1000 nas seguintes condições: injeção de 1 a 3 KVA, com eletroforese a 7KVA por aproximadamente 4 horas. A qualidade da seqüência foi verificada utilizando-se o programa de bioinformática Phred, sendo que foi realizado um estudo sobre as características e parâmetros desse programa. O alinhamento da seqüência obtida com as depositadas no banco de dados do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) foi realizado usando o programa Clustal W (EMBL-EBI).