Para fazer as mutações específicas no gene de ADSL-hum, clonada no vetor pMal-c foi utilizada uma técnica de mutagênese “QuikChange site-directed mutagenesis Kit”. A expressão da enzima ADSL-hum nativa e mutantes foi realizada com células competentes de Escherichia coli DH5α que foram transformadas com o plasmídeo recombinante.

A proteína de interesse é expressa junto com a MBP (Maltose Binding Protein) que tem afinidade pela amilose. Portanto, o primeiro passo de purificação consistiu de uma cromatografia por afinidade. Já o segundo passo empregado foi cromatografia por exclusão molecular.

Medidas de espalhamento dinâmico de luz (DLS) de cada enzima pura foram empregadas para determinação de sua forma oligomérica, bem como seu peso molecular.

O ensaio da atividade de cada enzima foi realizado monitorando-se o decréscimo da absorbância a 282nm no espectrofotômetro UV-1650 PC (Schimadzu). As medidas foram feitas a 25°C por 1 min. 5ng de enzima pura foram adicionados a 500μl do tampão A (Tris/base 10 mM pH 7,5, EDTA 2 mM, KCl 10 mM, DTT 1 mM, glicerol 4%), onde a proteína é estável (Kmoch et al., 2000), contendo diferentes concentrações de substrato. Para determinar o K_m para adenilosuccinato foram utilizadas as seguintes concentrações de substrato: 2,34μM; 3,12 μM; 4,68 μM; 6,25 μM; 9,37 μM; 12,5 μM; 18,75 μM; 25μM; 37,5 μM; 50μM e 70μM.

Os resultados da expressão em larga escala revelaram uma boa quantidade da proteína presente no sobrenadante.

O primeiro passo de purificação da ADSL-hum mostrou-se bastante eficiente, pois a amostra eluída apresenta, relativamente, um alto grau de pureza, e o segundo passo de purificação demonstrou-se eficiente em relação ao grau de pureza obtido para ADSL. Os resultados obtidos para a expressão e purificação dos mutantes G1343A, C63T, T395C e G857A foram tão satisfatórios como os da enzima nativa.

A determinação do peso molecular aparente e da forma oligomérica da enzima ADSL-hum nativa e dos mutantes, foi realizada através de DLS, apresentando resultados consistentes com os dados teóricos. As medidas de DLS, da amostra contendo ADSL-hum nativa, resultaram num raio hidrodinâmico médio de 7,33nm. Os resultados medidos para os mutantes G1343A, C63T, T395C e G857A foram, respectivamente, 7,04nm, 6,69nm, 6,02nm e 6,26nm. Esses valores são equivalentes à forma oligomérica tetramérica. Além disso, esta metodologia também mostrou que as amostras apresentaram-se homogêneas.

Para a realização dos ensaios enzimáticos foi utilizado o substrato S-AMP. Com as medidas das absorbâncias obtidas para as diferentes concentrações de substrato foi possível plotar o gráfico de Michaelis Menten  e calcular o valor de k_m para cada mutante. Os valores obtidos de Km foram de 3,2 μM (enzima nativa), 16,8 μM (G1343A) e 0,048 (C63T). Os mutantes T395C e G857A não apresentaram atividade.

	A purificação da ADSL-hum envolvendo a cromatografia por afinidade em resina de amilose, complementada pela cromatografia por exclusão molecular em coluna Superdex 200 foi satisfatória. 

Através do DLS, pode-se determinar o raio hidrodinâmico das enzimas estudadas, sendo estes aproximadamente iguais ao descrito na literatura para a enzima nativa na condição tetramérica.

Os ensaios enzimáticos permitiram confirmar que a ADSL-hum nativa e os mutantes permaneciam ativos após sua purificação e determinar os valores de K_m para o substrato adenilosuccinato. Para o melhor esclarecimento do aumento, diminuição ou ausência de atividade enzimática, serão realizados estudos da comparação da atividade enzimática e da localização das mutações na proteína.