| E. Ciências Agrárias - 5. Medicina Veterinária - 3. Medicina Veterinária Preventiva |
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DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE UM SISTEMA DE SEMI-NESTED PCR PARA A DETECÇÃO DO GENE N DO CORONAVÍRUS BOVINO EM FEZES DIARRÉICAS DE BEZERROS NATURALMENTE INFECTADOS |
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| Michele Lunardi 1 |
| Gustavo Henrique Rodrigues Romero 2 |
| Glei dos Anjos de Carvalho 3 |
| Thaine Bordenowsky da Silva 4 |
| Guilherme Basseto Braga 5 |
| Amauri Alcindo Alfieri 6 |
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| (1. Universidade Estadual de Londrina / UEL; 2. Universidade Estadual de Londrina / UEL; 3. Universidade Estadual de Londrina / UEL; 4. Universidade Estadual de Londrina / UEL; 5. Universidade Estadual de Londrina / UEL; 6. Prof. Dr. do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva / UEL) |
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| INTRODUÇÃO: |
As diarréias neonatais constituem-se em um dos principais problemas sanitários para os bovinos e são responsáveis por altas taxas de morbidade e de mortalidade em bezerros com até 30 dias de idade em todo mundo. Os episódios de diarréia em bezerros tanto de corte quanto de leite, determinam grandes prejuízos econômicos à atividade pecuária no Brasil. Entre os processos de etiologia viral, o coronavírus bovino (BCoV) está entre os patógenos mais freqüentemente diagnosticados. Atualmente o diagnóstico do BCoV é realizado por técnicas laboriosas, que demandam muito tempo para a conclusão dos resultados e apresentam baixa sensibilidade e especificidade como hemaglutinação (HA) / inibição de hemaglutinação (HI) e sistemas de ELISA. O desenvolvimento de técnicas de biologia molecular como a Transcrição Reversa seguida da Reação em Cadeia pela Polimerase (RT-PCR), tem contribuindo tanto na detecção quanto em estudos epidemiológicos e moleculares de vários vírus em medicina veterinária particularmente devido à sua alta sensibilidade e especificidade, comparada aos outros métodos de diagnóstico utilizados. Este trabalho teve por objetivo desenvolver, padronizar e avaliar a técnica de semi-nested PCR para a amplificação parcial do gene da nucleoproteína (N) do BCoV, e realizar um inquérito epidemiológico sobre a presença desse vírus em fezes diarréicas de bezerros provenientes de rebanhos de corte e de leite do Estado do Paraná. |
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| METODOLOGIA: |
Para o desenvolvimento da semi-nested PCR foram desenhados primers a partir de uma seqüência de nucleotídeos altamente conservada presente no gene N da estirpe Mebus do BCoV. Para o primeiro ciclo de amplificação foram empregados os primers BCoV1: 5’ CGATGAGGCTATTCCGAC 3’ e BCoV2: 5’ TGTGGGTGCGAGTTCTGC 3’, que amplificam um fragmento com 454 pb. Para o segundo ciclo de amplificação, foram utilizados os primers BCoV3: 5’ TTGCTAGTCTTGTTCTGGC 3’ e BCoV2 para produzir um fragmento com 251 pb. O sistema foi avaliado frente a uma amostragem constituída por 50 amostras de fezes diarréicas de bezerros previamente monitorada quanto a presença de BCoV por meio de uma reação de RT-PCR realizada de acordo com a literatura. Os produtos amplificados foram analisados com a enzima de restrição Hae III e por seqüenciamento. Para a avaliação da especificidade da técnica frente a outros enteropatógenos foram utilizados extratos fecais diarréicos provenientes de bezerros naturalmente infectados com E.coli, rotavírus grupo A e Criptosporidium spp. Para o trabalho de epidemiologia da coronavirose foram utilizadas 117 amostras de fezes diarréicas de bezerros. As amostras foram preparadas a 10 % (p/v) ou a 50 % (v/v) em 0,01 M de PBS pH 7,2, conforme a consistência das amostras, semi-sólidas e líquidas, respectivamente. A extração do ácido nucleico (RNA fs) foi realizada por meio de uma combinação das técnicas de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico e sílica/isotiocianato de guanidina. |
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| RESULTADOS: |
A técnica de semi-nested PCR padronizada apresentou alta sensibilidade e especificidade quando comparada com a RT-PCR (K=0,43). Tanto a clivagem com enzima de restrição, que produziu dois fragmentos com 163 e 88 pb, quanto as reações de seqüencimento confirmaram a especificidade do amplicon. Não houve reação inespecífica frente aos outros três enteropatógenos (bactéria, vírus e protozoário) de importância nos episódios de diarréia neonatal bovina investigados. Das 117 amostras de fezes diarréicas de bezerros analisadas neste estudo, em 28,2% (33/117) foi possível a amplificação do gene N do BcoV. |
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| CONCLUSÕES: |
A semi-nested PCR desenvolvida e avaliada neste trabalho é uma ferramenta adequada e eficaz para a detecção do BCoV em fezes de bezerros naturalmente infectados. Os resultados, quando comparados com a RT-PCR, evidenciaram uma taxa de positividade significativa. A técnica mostrou-se altamente específica para o gene N do BcoV. A taxa de 28,2% de amostras de fezes diarréicas positivas para o BCOV demonstra a importância desse vírus na etiologia das diarréias neonatais bovinas. A detecção do BCoV em fezes de bezerros do Estado do Paraná demonstra a importância desse vírus nos episódios de diarréia neonatal em bezerros de rebanhos bovinos com aptidão tanto para corte quanto para leite em uma região onde a pecuária bovina é uma importante atividade do agronegócio. Esses resultados evidenciam ainda a necessidade de adoção e do monitoramento de medidas de controle e profilaxia dessa virose que é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em bezerros, principalmente no período mais crítico da criação que vai do nascimento até os 60 dias idade. A utilização de métodos de diagnóstico molecular propicia maior rapidez no diagnóstico, a definição da real presença ou ausência de um determinado enteropatógeno em rebanhos de produção, além de fornecer material para análises moleculares que fornecem dados da epidemiologia molecular e da presença ou ausência de variantes moleculares e/ou antigênicas que podem interferir negativamente nos processo de imunoprofilaxia. |
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Instituição de fomento: CNPq, CAPES e Fundação Araucária (FAP/PR).
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Trabalho de Iniciação Científica
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Palavras-chave: coronavírus bovino; bezerros; semi-nested PCR. |
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| Anais da 58ª Reunião Anual da SBPC - Florianópolis, SC - Julho/2006 |