| C. Ciências Biológicas - 13. Parasitologia - 1. Entomologia e Malacologia de Parasitos e Vetores |
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IDENTIFICAÇÃO DE LEISHMANIOSE VISCERAL AMERICANA EM CÃES ERRANTES ATRAVÉS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR |
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| Letícia Tsieme Gushi 1 |
| Paulo Eduardo Martins Ribolla 1 |
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| (1. Depto. de Parasitologia - Instituto de Biociências - UNESP Campus de Botucatu) |
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| INTRODUÇÃO: |
A Leishmaniose Visceral, também conhecida como calazar, é uma doença infecciosa crônica que tem como sintomas clássicos: febre irregular e distensão abdominal ocasionada pelo aumento de volume de órgãos como fígado e baço. Em pacientes não tratados os níveis de mortalidade podem chegar a 90% . O agente etiológico pertence ao gênero Leishmania, sendo que no Novo Mundo a espécie representante é Leishmania chagasi. Possui como vetor o mosquito da espécie Lutzomyia longipalpis, vulgarmente conhecido como mosquito - palha. A transmissão ocorre através da picada do mosquito, durante o repasto sangüíneo, este inocula pela probóscide as formas promastigotas metacíclicas. Os cães são considerados reservatórios domésticos e o principal elo na manutenção do ciclo urbano da doença. Há uma grande associação entre o número de cães infectados com casos de pessoas doentes. O método de diagnóstico mais utilizado atualmente é o de imunofluorescência indireta, baseada na reação antígeno-anticorpo onde formas promastigotas são utilizadas como antígeno. Apesar da simples execução e alta sensibilidade fornece reações cruzadas com outros tripanossomatídeos, podendo fornecer diagnósticos falsos - positivo, gerando o sacrifício desnecessário de cães. Recentemente, estudos comprovam a validação da PCR (reação em cadeia de polimerase) no diagnóstico de leishmaniose visceral, pois possuindo alta sensibilidade e especificidade obtém-se resultados mais precisos. Assim, este trabalho teve como objetivo verificar a presença do parasita Leishmania chagasi em cães sintomáticos e assintomáticos, cães que possam ter entrado em contato com o parasita, de regiões endêmicas; para que possa haver efetiva prevenção e controle do avanço dessa zoonose. |
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| METODOLOGIA: |
O método proposto baseia - se na amplificação específica de regiões conservadas do cinetoplasto dos organismos do gênero Leishmania. A amostragem consistiu na coleta de tecidos diversos de cães sintomáticos que habitavam regiões onde a doença é endêmica, como ocorre no estado do Piauí e na região da cidade de Araçatuba (SP). Para a extração do DNA, utilizou - se o NucleoSpin Blood Kit (Macherey - Nagel), seguindo o protocolo que acompanha o Kit. Em seguida, foi realizada a amplificação através dos oligonucleotídeos LinR4 (5’- GGG GTT GGT GTA AAA TAG GG-3’) e Lin19 (5’- CAG AAC GCC CCT ACC CG- 3’). A análise dos produtos de PCR foi realizada através do método de eletroforese, aplicados em gel de agarose a 1%, corado com brometo de etídeo e visualizados em luz U.V. Os produtos amplificados foram clonados em vetor (p-GEM-T) e posteriormente um clone seqüenciado conforme instruções do kit BigDye ver 3.0 (Applied Biosystems). Após a reação de seqüenciamento, os produtos foram analisados em Seqüenciador Applied 377. As seqüências obtidas das duas direções do clone escolhido foram sobrepostas com a utilização do pacote EMBOSS GUI (http://bioinfo.hku.hk/EMBOSS/) via internet com o auxílio do programa merger. Depois de sobrepostas, as regiões referentes ao plasmídeo foram desprezadas e a seqüência obtida (707 pares de base) alinhada com outras seqüências com a utilização do programa CLUSTALW. Os diagramas que comparam as seqüências foram visualizados com o programa TREEVIEW. |
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| RESULTADOS: |
Foram consideradas positivas as amostras que após o PCR apresentaram um produto amplificado de aproximadamente 720 pares de bases visualizados por eletroforese em gel de agarose.Das quarenta e cinco amostras de diferentes tecidos analisados, seis foram negativas, sendo amostras de plasma seminal, sêmen do epidídimo e líquor braquial cefálico, tecidos que normalmente não ocorrem quantias significativas do parasita. A amostra de sangue que apresentou resultado negativo era de um cão assintomático. Para outros tecidos analisados, a técnica de diagnóstico mostrou-se sensível e apresentou dois resultados negativos para: medula e baço (4,4% do total de amostras). O produto de PCR obtido da amostra provinda de aspirado de medula de cão infectado de Teresina (Piauí) foi clonada em vetor p-GEM-T para posterior seqüenciamento. O resultado do seqüenciamento mostra um produto de 702 pares de base que, quando submetido ao GENBANK para comparação com seqüências depositadas, mostrou similaridade com seqüências de outras espécies de Leishmania. O diagrama obtido da comparação das seqüências mostra que a seqüência obtida neste trabalho apresenta maior similaridade com L. chagasi. |
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| CONCLUSÕES: |
O método de análise por PCR foi escolhido por mostrar - se um método simples, específico e de resultados rápidos. Além de que a possibilidade de resultados falsos positivos é mínima, diferente do método de imunofluorescência que possui reação cruzada com Tripanossoma sp e também oferece resultados positivos em pacientes tratados que apesar de não terem mais o protozoário possuem anticorpos para este. Outra vantagem está na sua amostragem, com este método é possível o diagnóstico feito através de sangue periférico, pois sua coleta é menos invasiva do que a coleta de aspirados de linfonodos e medula além de que a eficiência do diagnóstico não é afetada. O método de diagnóstico através da técnica de PCR (reação de polimerização em cadeia) mostrou - se eficiente em aproximadamente 93,3% das amostras analisadas, o que aponta para um diagnóstico rápido, eficiente e altamente específico. O kDNA se apresenta polimórfico dentro de cada indivíduo, mas poderá ser utilizado como marcador de linhagens de Leishmania chagasi. Novas seqüências estão sendo obtidas deste e de outras amostras do parasito. O estudo dos polimorfismos presentes nestas seqüências poderá fornecer informações sobre as diferentes cepas do parasito e correlações das cepas com virulência e/ou resistência a quimioterápicos. |
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Instituição de fomento: CNPq / PIBIC
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Trabalho de Iniciação Científica
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Palavras-chave: Leishmaniose visceral; Diagnóstico molecular; Cães. |
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| Anais da 58ª Reunião Anual da SBPC - Florianópolis, SC - Julho/2006 |
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