| E. Ciências Agrárias - 5. Medicina Veterinária - 5. Reprodução Animal |
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PRODUÇÃO DE EMBRIÕES CLONES BOVINOS UTILIZANDO A TÉCNICA DE “HANDMADE CLONING” E DE CULTIVO IN VITRO “WELL OF THE WELL” |
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| Cristiano Feltrin 1 |
| Fabiana Forell 1 |
| José Luiz Rodrigues 1 |
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| (1. LABORATÓRIO DE EMBRIOLOGIA E BIOTÉCNICAS DE REPRODUÇÃO - UFRGS) |
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| INTRODUÇÃO: |
A baixa eficiência na produção in vitro de embriões clones bovinos tem dificultado a difusão desta biotécnica no âmbito da reprodução. A técnica de “handmade cloning” (HMC) exige a utilização de um menor número de equipamentos e menor tempo de treinamento, o que permite sua realização por laboratórios menos equipados, além de proporcionar a reconstituição de um número maior de estruturas embrionárias por rotina quando comparado a técnica de clonagem convencional. O objetivo deste experimento foi de otimizar a técnica de HMC, descrita por Vajta (2003), através da simplificação da técnica e de modificações no sistema “Well of the Well” (W.O.W), o qual é utilizado no cultivo in vitro de embriões clones produzidos através do HMC. |
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| METODOLOGIA: |
Oócitos bovinos coletados de ovários de abatedouro foram maturados in vitro durante 17 horas. Após a digestão enzimática (Pronase-E) da zona pelúcida, os oócitos foram divididos manualmente em partes iguais com o auxílio de uma lâmina de microssecção (Ultra Sharp Splitting Blade - AB Technology). As metades dos oócitos que não apresentavam DNA foram coradas com Hoeschst 33342 e visualizadas com o auxílio de um microscópio invertido equipado com luz UV. Em seguida, a reconstituição do volume citoplasmático inicial do oócito foi obtida utilizando-se duas metades sem DNA mais a célula somática bovina (célula doadora de núcleo), através da exposição à fitohemoaglutinina, a qual proporciona a agregação de tais estruturas. Finalmente, as membranas citoplasmáticas dos complexos oócitos receptores - núcleos doadores (CRND) foram fusionadas com o auxílio de uma câmara acoplada a um eletrofusor. A indução da ativação e a reprogramação nuclear dos CRND foi realizada pela exposição à ionomicina, a qual promove uma oscilação na concentração do íon cálcio intracelular e 6-dimetilaminopurina, cuja ação é inibir a cascata de fosforilação, permitindo, assim, o início do desenvolvimento embrionário. No cultivo in vitro, realizado em Fluído Sintético de Oviduto, suplementado com aminoácidos e soro fetal bovino, os CRNDs foram divididos em dois grupos (cinco replicações no sistema de cultivo “well of the well”) – Grupo 1 (G1): poço modificado; Grupo 2 (G2): poço convencional. |
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| RESULTADOS: |
No G1, a taxa de clivagem foi de 81,4 % (79/97) e a taxa de blastocisto foi de 32,9% (32/97). No G2, a taxa de clivagem foi de 69,3% (68/98) e a taxa de blastocisto foi de 19,3% (19/98). |
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| CONCLUSÕES: |
As simplificações realizadas na técnica de HMC otimizaram os resultados além de tornar mais simples sua realização. Além disso, as modificações realizadas no sistema de cultivo W.O.W permitiu um incremento nas taxas de clivagem e de blastocisto, por proporcionar uma maior agregação entre os blastômeros durante o desenvolvimento embrionário. |
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Instituição de fomento: Cnpq
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Trabalho de Iniciação Científica
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Palavras-chave: clonagem; embriões; cultivo. |
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| Anais da 58ª Reunião Anual da SBPC - Florianópolis, SC - Julho/2006 |