O cacaueiro (Theobroma cacao) é uma espécie nativa da floresta tropical úmida americana, sendo o seu provável centro de origem as nascentes dos rios Amazonas e Orinoco (Gramacho et al., 2002). A maior parte da cacauicultura do Sul da Bahia é cultivada num sistema denominado cabruca (Mata Atlântica raleada sobre o cultivo de cacau), permitindo uma maior diversidade flora e fauna. A lavoura do cacau sempre foi a maior fonte de renda da região sul da Bahia. Contudo, no final da década de 1980, essa atividade agrícola foi grandemente afetada principalmente pela introdução do agente causal da doença vassoura de bruxa na região, o fungo Crinipellis perniciosa (Pereira et al., 1989). Várias frentes de combate ao fungo foram deflagradas na última década, porém sem apresentar resultados definitivos. Métodos de controle de fitopatógenos mais eficientes podem ser desenvolvidos com base nas interações moleculares do patossistema, uma vez que o primeiro passo na interação planta:patógeno é a ativação de um mecanismo de resposta por moléculas elicitoras. Geralmente, os elicitores são liberados nos espaços inter ou intracelulares do hospedeiro e, dependendo das características genéticas dos organismos, promovem a infecção ou ativam o sistema de defesa da planta (Torto et al., 2003).

A metodologia proposta foi induzir a expressão diferencial de genes do C. perniciosa e posteriormente avaliar o potencial patogênico dos diversos extratos extracelulares secretados pelo patógeno. Para tanto, o experimento foi conduzido no laboratório de Genética e Biologia Molecular da Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus - Ba. Dois discos de micélio do C. perniciosa foram colocados para crescer em meio mineral, sólido e líquido, acrescido de diferentes fontes de carbono. O crescimento radial do fungo no meio sólido foi acompanhado por um período de 14 dias, sendo o diâmetro medido a cada dois dias. Transcorrido esse tempo, as proteínas secretadas por C. perniciosa no meio líquido foram quantificadas pelo método de Bradford e posteriormente isoladas por precipitação com sulfato de amônio ou por extração com fenol. O perfil protéico dos extratos foi analisado através da focalização isoelétrica e SDS PAGE. Spots individualizados representativos de cada tratamento foram retirados dos géis bidimensionais. A validação biológica da atividade patogênica das proteínas foi conduzida mediante a infiltração dos extratos em meristema apical de plantas de T. cacao (cacau) e em folhas de Nicotiana tabacum (tabaco). O acompanhamento diário no desenvolvimento ou não de necrose revelou atividades virulentas contrastantes de acordo com o meio utilizado. Para que se pudesse identificar dentre as proteínas extracelulares, quais são as responsáveis em induzir necrose, amostras de proteínas secretadas foram fracionadas em HPLC e as frações coletadas foram resolvidas em gel bidimensional e infiltradas em tabaco.

Os resultados encontrados têm mostrado que a adição dos indutores selecionados foi eficiente tanto na indução de padrões de crescimento divergentes nos meios com diferentes fontes de carbono, quanto na indução diferencial de genes que codificam para proteínas extracelulares. A análise dos diferentes perfis protéicos observados nos tratamentos constatou que a maioria das proteínas extracelulares de C. perniciosa possuem peso molecular numa faixa de 20 a 60 Kda. A análise dos extratos protéicos também revelou que a quantidade total de proteínas extracelulares de C. perniciosa se mostrou conservada nos diferentes tratamentos, sendo de aproximadamente 1 micrograma por microlitro. A análise do perfil protéico via focalização isoelétrica seguida de SDS PAGE indicou que os meios testados induziram no patógeno uma expressão diferencial de genes que codificam para proteínas extracelulares. As frações de proteínas geradas pelo HPLC foram resolvidas em SDS PAGE e visualizadas mediante coloração com nitrato de prata (Sambrook et al., 1989) revelando diferentes perfis protéicos nas frações coletadas. Numa etapa posterior 100 microlitros das proteínas coletadas foram infiltradas em plantas de tabaco e revelou diferente cinética na indução de necrose, sugerindo que as frações possuem diferentes atividades patogênicas.

Os resultados obtidos mostraram que a metodologia proposta para identificar proteínas extracelulares de C. perniciosa relacionadas com a patogenicidade em Theobroma cacao é eficaz e fazendo-se os devidos ajustes poderá ser utilizada em experimentos futuros visando validar a atividade de proteínas individualizadas.

Instituição de fomento: CNPq, BNB, CAPES, FAPESB

Trabalho de Iniciação Científica