O Brasil hoje é o maior produtor de frutos de mamão do mundo. Esta cultura tornou-se uma das principais atividades econômicas da fruticultura brasileira (1,7 milhão de toneladas em 2000), o que corresponde a 43% da produção mundial. O Estado do Rio Grande do Norte triplicou sua produção nos últimos três anos, correspondendo hoje a 20% das nossas exportações em fruticultura. Entretanto, o manejo da cultura apresenta alguns problemas, como por exemplo, a incidência de viroses que, em certos casos, podem provocar perdas de até 80% da produção. Três tipos de vírus, entre os dez que atacam o mamoeiro, já foram identificados no Brasil: Papaya RingSpot Virus (PRVS), Papaya Mosaic Virus (PMV) e Papaya Meleira Virus (PMeV), que foi recentemente identificado no país.

   Os dois primeiros vírus, PRSV e PMV, tiveram seus genomas clonados e correspondem a moléculas de RNA de, respectivamente, 10326 e 6656 bases. Sendo conhecido a seqüência do genoma viral, é possível diagnosticar a sua presença nos tecidos vegetais mediante escolha de oligonucleotídeos para realização de reação de PCR. Este detecção pode representar importante economia para os produtores de frutos no manejo das plantações de mamão, assim como viabiliza estudos sobre o desenvolvimento da infecção sistêmica do mamoeiro. O último vírus citado, o PMeV, ainda encontra-se em fase de seqüênciamento, embora se saiba tratar de uma molécula de RNA.

            O Papaya RingSpot Virus, PRSV, é responsável pela patologia da mancha anelar. Trata-se de uma virose com grande alcance nacional, sendo registrada em todas as regiões de produção de mamão brasileiras. A sintomatologia é caracterizada inicialmente na forma de mosaico, distorção foliar e, posteriormente, anéis oleosos nos frutos, que são os principais sintomas, e manchas oleosas no caule. O controle dessa virose em plantas de mamão foi realizado através da identificação dos sintomas da doença, com posterior eliminação das plantas infectadas para evitar a contaminação do pomar. O diagnóstico foi feito a partir de técnicas moleculares que permitiram a identificação dos vírus, isto é, uma metodologia de identificação por RT-PCR foi implementada no sentido de identificar precocemente o PRSV.

            O Papaya Meleira Virus, PMeV, causa a virose conhecida como “meleira” ou “doença viscosa”. A doença manifesta-se com sintomas de mosaico, distorção foliar e, posteriormente, anéis oleosos nos frutos e manchas oleosas no caule; mudas infectadas apresentam nervuras clareadas e encurvamento de folhas jovens, que posteriormente tornam-se mosqueadas e distorcidas, com lóbulos bastante reduzidos em tamanho; uma queimadura observada nas extremidades das plantas jovens e uma exsudação de látex fluido, que torna-se oxidado na margem de folhas jovens são os sintomas mais característicos. Esse exsudato também é observado nos frutos verdes mais tarde desenvolvidos pelas plantas infectadas. Assim como na mancha anelar, o controle dessa virose nos mamoeiros é feito através da eliminação das plantas que apresentam o quadro de sintomas já citado. Através de ferramentas da biologia molecular, pode ser feito o diagnóstico precoce do PMeV. Trata-se de um teste de detecção viral que emprega uma metodologia de técnicas de eletroforese para RNA e proteínas.

            O Papaya Mosaic Virus, PMV, causa uma virose cujos sintomas incluem manchas foliares e discretas manchas anelares nos frutos. Os mamoeiros que desenvolvem esta virose não possuem sintomas de mancha anelar ou meleira. A identificação do vírus foi feita utilizando-se técnicas de biologia molecular envolvendo reações de RT-PCR com oligonucleotídeos específicos.

           Para os testes de detecção do PRSV, a metodologia empregada compreende reações de amplificação por RT-PCR. A extração de RNA para RT-PCR foi realizada segundo dois protocolos utilizando-se o kit SV Total RNA Isolation (Promega) e um protocolo modificado contendo Guanidine thiocyanate como agente desnaturante no tampão de extração (19,1g de guanidine thiocyanate; 0,089g de MES; 1ml de EDTA 0,5M em 25ml de água). Com o RNA total de plantas sadias e afetadas pelos vírus, alíquotas de 2g foram empregadas para as reações de RT-PCR. O cDNA resultante foi amplificado sob condições clássicas de PCR. Os produtos destas reações foram seqüenciados, revelando tratar-se do PRSV e também analisados por eletroforese em gel de agarose 1,5% / TBE 0,5X. O RNA total extraído de plantas sintomáticas e assintomáticas também foi submetido à eletroforese nas mesmas condições empregadas para o DNA.

            O PMV foi identificado mediante amplificação por RT-PCR. Amostras de plantas com sintomas da virose tiveram seu RNA extraído através do protocolo modificado contendo Guanidine thiocyanate já referido. Alíquotas de 1mg do RNA extraído serviram de molde para reações de RT-PCR e o cDNA obtido foi amplificado em condições clássicas. As reações foram analisadas em eletroforese em gel de agarose 1,5% / TBE 0,5X.

A clonagem do PMeV foi iniciada a partir de experimentos de visualização do vírus indispensável para estimar seu tamanho e planejar as estratégias de obtenção de bibliotecas de cDNA. Isto permitiu criar testes para identificação, através do RNA total de plantas sadias e virosadas (protocolo modificado de Guanidine thiocyanate). Uma vez extraído, o RNA viral foi visualizado em eletroforese em gel de agarose 1,5% / TBE 0,5X. Para confirmar e otimizar o teste de detecção do vírus foi realizada extração de proteínas de plantas normais e afetadas com tampão de extração (1 ml de Tris 0,1M pH 8; 10 ml de fenol, 500 ml de b-mercaptoetanol em 8,5 ml de água). Os extratos protéicos foram submetidos à eletroforese SDS-PAGE em gel de poliacrilamida 12,5% (stacking) e 3% (resolving) e tampão de glicina 0,192M.

           Para os experimentos de identificação e detecção do PRSV, o protocolo modificado de extração de RNA mostrou-se eficiente na preparação de cDNA total, permitindo que na reação de RT-PCR fosse amplificado um fragmento do genoma do PRSV. O fragmento de PCR de 941 pb gerado por primers específicos, foi seqüenciado e corresponde às regiões codantes dos genes para a proteína b de inclusão nuclear e para a proteína do capsídeo viral presentes no genoma. A otimização da identificação do PRSV em plantas com alto nível de infecção permitiu a amplificação de banda específica a partir de concentrações iniciais de cDNA de plantas doentes que variam de 20 a 0,2ng. A corrida de eletroforese do RNA evidenciou uma banda de cerca de 10000 bases na pista correspondente às plantas virosadas, indicando que tratar-se do genoma do PRSV.

            As reações de RT-PCR aplicadas na identificação do PMV deveriam, de acordo com os primers específicos selecionados, amplificar um fragmento de 226 bases do genoma viral. Este fragmento corresponde à parte da região que codifica a replicase. Entretanto, foi amplificado um fragmento de 200 bases, que não se repetiu nas plantas assintomáticas, foi seqüenciado e sugere tratar-se de um fragmento do genoma do PMV.

            A eletroforese em gel de agarose para RNA do PMeV apontou a presença de uma banda de aproximadamente 12000 bases observada na pista contendo RNA de plantas com sintomas de meleira. Esta banda não foi visualizada na pista que continha RNA de plantas saudáveis, sugerindo tratar-se do genoma viral.

            O gel SDS-PAGE separou bandas de proteínas na faixa que compreende 14 a 45 kDa na pista que contém extratos protéicos de plantas com sintomas de meleira. Estas proteínas não são encontradas nas plantas sadias, indicando tratar-se provavelmente de proteínas capsidiais do PMeV. 

           Os testes de detecção para PRSV e PMeV foram implementados com sucesso, com otimização do teste para o primeiro vírus. Os testes de identificação do PMV realizados obtiveram bandas correspondentes a fragmentos do genoma viral, embora não do tamanho esperado.

As extrações de RNA com o protocolo desenvolvido e modificado em laboratório mostraram-se eficientes, permitindo a visualização dos genomas de ambos os vírus e viabilizando as reações de RT-PCR, comprovadas pelo cDNA produzido.

A clonagem do PMeV está em andamento. As reações de RT-PCR para produzir as bibliotecas de cDNA por screening diferencial estão sendo feitas.