A produção de feijão pelo Brasil ainda é modesta, sendo considerada de subsistência. Um fator limitante são as sementes usadas pelos produtores, que, segundo estimativas da Embrapa (2004), apenas 20% são de boa qualidade. Isso se deve, em grande parte, ao fato de a maioria das doenças do feijoeiro serem transmitidas pela própria semente contaminada, que pode comprometer a lavoura desde o seu início e pela falta de recursos, por parte dos agricultores, para adquirir sementes de boa qualidade. Desta forma, são de fundamental importância estudos voltados para o entendimento e controle de doenças do feijoeiro. A antracnose é uma das doenças mais comuns e severas do feijoeiro. É causada por um fungo filamentoso, cuja fase assexuada recebe o nome de Colletotrichum lindemuthianum. Esse patógeno afeta plantas de feijão em todos os estágios do desenvolvimento, atacando folhas, caules, ramos, vagens e sementes. O fungo sobrevive em restos de cultura, mas sementes contaminadas constituem sua via de disseminação mais importante. Uma das grandes dificuldades encontradas no controle desta doença é a enorme variabilidade genética presente neste fungo, fazendo com que ele ocorra em diversas raças fisiológicas, impossibilitando assim o uso em longo prazo de cultivares resistentes. O objetivo desse trabalho foi identificar, isolar e caracterizar genes de patogenicidade do fungo fitopatogênico Colletotrichum lindemuthianum, justamente com o intuito de acrescentar conhecimento no que diz respeito ao processo molecular da infecção desse fungo em feijoeiro. E para tanto utilizou-se a transformação por REMI (Inserção Mediada por Enzima de Restrição). Esta técnica diferencia-se das demais técnicas de transformação por inserção de plasmídeo pelo fato de nesta ser utilizado enzima de restrição para clivar o plasmídeo e a mesma para clivar o genoma do fungo, durante o processo de transformação, gerando transformantes com cópia (s) do plasmídeo distribuídas mais aleatoriamente que nas técnicas de etiquetagem gênica tradicionais. Além de ser uma das forma mais randômica de se obter transformantes, sua alta eficiência torna essa técnica muito interessante para etiquetagem gênica, visto que, para esse propósito, é necessário grande número de transformantes para triagem dos genes de interesse.

Foi utilizado isolado LV49 (raça 81) de C. lindemuthianum assim como o cultivar de feijoeiro ROSINHA susceptível a essa raça. A transformação de protoplastos foi realizada através da técnica REMI, utilizando-se a enzima de restrição BamHI, com o plasmídeo pAN7.1, que confere resistência ao antibiótico higromicina (gene hph). Os transformantes foram selecionados em meio BDA enriquecido contendo sacarose como estabilizador osmótico e o antibiótico. O ensaio de patogenicidade foi realizado de acordo com Dufresne et al. (1998). Folhas primárias do cultivar ROSINHA foram excisadas após 8 dias de plantio do feijoeiro, e inoculadas com uma suspensão de 1,0 x 106 esporos/mL sendo mantidas em placas de Petri, a 21 °C com 16 horas de luminosidade. O aparecimento das lesões foi monitorado por 10 dias. Foi verificado presença de apressório melanizado. A extração de DNA do fungo foi realizada utilizando protocolo estabelecido para fungos do gênero Aspergillus (Prebble e Anderson, 1998), com modificações. A verificação do número de inserções do plasmídeo foi realizado com a clivagem do DNA total da raça 81 de C. lindemuthianum a enzima de restrição HindIII, que apresenta um sítio de restrição no plasmídeo pAN7.1, e com ClaI, ApaI e KpnI que não apresentam sítio no mesmo. O DNA clivado foi separado por eletroforese em gel de agarose 0,8% e transferido para uma membrana de náilon. O número de cópias do plasmídeo presentes no genoma do fungo foi, então, determinado por hibridização, tendo o próprio plasmídeo marcado como sonda, utilizando a técnica de Southern blot (Sambroock et al, 1989). O DNA do mutante RS1 foi clivado com enzima de restrição e ligado com DNAligase. Os fragmentos foram utilizados para eletroporar E. coli. Os fragmentos resultantes de clivagem plasmidial foram ligados no vetor pBluescript®II KS (+/-) Phagemids e utilizados para eletroporar células de Escherichia coli K12 DH5.

Foi observado um mutante não patogênico (RS1) entre 22 transformantes analisados. O DNA deste mutante foi clivado com enzimas de restrição que não possuem sitio de restrição no plasmídeo (ClaI, ApaI e KpnI) e com uma que possui um sítio (HindIII). O resultado da hibridização, revelou que foi inserida uma única cópia do plasmídeo. O DNA total do mutante clivado com a enzima HindIII foi ligado e utilizado para transformar E. coli. Foi recuperado um plasmídeo de 5,5kb que foi clivado com DraI e o fragmento contendo o DNA genômico foi ligado ao vetor pBluescrip. A partir dos resultados obtidos pela verificação de apressório no mutante em comparação com a selvagem, foi observado que o mutante RS1 não é deficiente na produção de apressório, onde pode-se observar a presença de apressório melanizado no mutante assim como no selvagem.

O mutante RS1 possui uma única cópia do plasmídeo pAN7.1 em seu genoma, o que facilitará no processo de recuperação do plasmídeo integrado no genoma do fungo. Visto que o gene interrompido ainda não foi seqüenciado, não se pode inferir sobre sua função na patogenicidade do fungo C. lindemuthianum LV49. Tal mutante não é deficiente na produção de apressório melanizado e, portanto, o processo de patogenia foi interrompido em um estágio da infecção posterior a fixação do fungo na planta.

Instituição de fomento: FAPEMIG e CNPQ

Trabalho de Iniciação Científica