Nos últimos anos, as células da glia deixaram de ser vistas como tendo apenas funções de preenchimento de espaço, suporte e defesa. Um crescente número de evidências sugere que as células da glia desempenham um papel ativo no desenvolvimento e manutenção do sistema nervoso central (SNC). Células da glia secretam fatores de crescimento, componentes da matriz extracelular e fatores tróficos que regulam a diferenciação, maturação e sobrevivência de neurônios. O objetivo deste projeto é estudar fatores expressos pelas células da glia que afetem neurônios tanto em situações fisiológicas quanto em situações patológicas. O modelo utilizado neste estudo é o cerebelo de camundongos, onde existe uma íntima relação entre as células da glia e os neurônios. A influência de fatores secretados por células da glia na extensão de axônios de precursores neuronais de cerebelo bem como a participação do óxido nítrico (NO) na resposta à injúria neuronal foram estudadas in vitro, em dois novos ensaios desenvolvidos em nosso laboratório.

Ensaio de extensão axonal: Precursores de células granulares obtidas de animais de 3, 6 e 9 dias pós natal (P3, P6 e P9, principal tipo de neurônio do cerebelo, foram mantidos em cultura (1x10⁵ células/P35) na presença de meio condicionado por células da glia e o grupo controle recebeu meio de cultura fresco. Com o objetivo de estudarmos a participação das células da glia em um processo patológico, desenvolvemos um ensaio de injúria in vitro.

Ensaio de injúria: Foi realizada co-cultura de precursores de neurônios e de células da glia obtidas de camundongos P9 (3x10⁶ células/P35). Após um dia de cultura, foi realizada a remoção de células em uma faixa de cerca 300-400mm de largura na cultura, que denominamos “ferida”. Após diferentes períodos de tempo (1 a 7 dias), as culturas foram observadas ao microscópio óptico, fotogradas e a largura da faixa sem células bem como o número de células presentes nesse local foram determinados utilizando-se o aplicativo AdobePhotoshop®. Os inibidores de NOS (NO sintase) utilizados neste estudo foram: aminoguanidina (0,4mM), L-canavanina (0,4mM) e L-NAME (0,5mM).

Observamos um aumento no tamanho dos processos neuronais nas culturas que receberam meio condicionado em comparação às células que receberam meio fresco. Tal incremento foi igualmente notado em todas as idades estudas (3, 6 e 9 dias de idade), sendo que as células tratadas estenderam axônios aproximadamente duas vezes maiores que as células não tratadas. Nesses mesmos experimentos, as células que migraram para fora dos agregados celulares foram contadas e não observamos diferença no número de precursores neuronais migrantes em culturas tratadas ou não com meio condicionado. Dados da literatura mostram que NO é um dos fatores liberados pelas células da glia em resposta a uma injúria. Com base nesses dados, investigamos a participação de NO no fechamento da ferida in vitro utilizando inibidores de NO sintases (NOS). Na situação controle, o fechamento da ferida ocorreu em aproximadamente 7 dias, quando cerca de 80% do espaço aberto pela remoção das células estava preenchido por células da glia. O grupo tratado com L-NAME (inibidor da isoforma endotelial da NOS) não apresentou diferença em relação ao controle, no 7º dia a ferida apresentou-se aproximadamente 55% fechada. Já o tratamento com aminoguanidina (inibidor da isoforma induzível da NOS) apresentou diferenças em relação ao controle, retardando o fechamento da injúria. Enquanto o grupo controle, no 7º dia apresentava aproximadamente 80% da injúria fechada, o grupo tratado, no mesmo período de tempo, apresentou apenas 43%.

Nossos resultados indicam que as células da glia cerebelares sintetizam fatores solúveis que estão envolvidos tanto no desenvolvimento normal dos precursores neuronais cerebelares quanto nos processos de resposta à injúria. Sendo assim, pode-se dizer que as células da glia secretam fatores que são importantes para o crescimento axonal, mas o mesmo não se pode dizer acerca da participação destas moléculas no incremento da mobilidade celular. Sendo a aminoguanidina um inibidor da isoforma induzível da NOS, pode-se dizer que o NO está envolvido no fechamento da injúria e que, provavelmente, a isoforma induzível da enzima é a responsável por sua síntese nesta situação.