A tuberculose é uma enfermidade produzida pelo Mycobacterium tuberculosis, bactéria identificada por Koch em 1882. A mortalidade por tuberculose declinou em cerca de 70% nos últimos 30 anos, mas ainda permanece alta no Brasil, em comparação com outros países, inclusive na América Latina, sendo importante reconhecer a tuberculose como endemia nacional e mundial. A diferenciação de linhagens de M. tuberculosis, através de técnicas moleculares, tem se tornado uma ferramenta importante no estudo, controle e prevenção da doença. No Brasil existem poucos relatos sobre a epidemiologia molecular da tuberculose, e estudos nesta área podem auxiliar na implantação de medidas de controle dessa doença. Pesquisas recentes mostram que a diversidade genética das linhagens isoladas de M. tuberculosis de diferentes populações humanas pode variar consideravelmente e que a identificação de grupos geneticamente idênticos refletem o aumento do microrganismo entre os hospedeiros humanos. O desenvolvimento da biologia molecular tem permitido identificar diversos elementos genéticos do complexo M. tuberculosis, que permitem distinguir e tipificar. cepas distintas pertencentes à mesma espécie. Dessa forma, considerando a necessidade de um maior conhecimento sobre a transmissão da tuberculose, o objetivo deste estudo é avaliar o grau de similaridade entre as cepas de M. tuberculosis provenientes de pacientes com diagnóstico clínico de tuberculose pulmonar atendidos pelo Sistema Único de Saúde e pelo Instituto Parreiras Horta.

Foram coletados escarros de pacientes com diagnóstico clínico de tuberculose pulmonar atendidos no Estado de Sergipe e município de Aracaju. As baciloscopias e culturas dessas amostras foram realizadas. As culturas foram incubadas a 37°C, por 4-6 semanas. Após o crescimento, os DNA genômico das culturas positivas foram extraídos para a realização da genotipagem. Foi utilizada a linhagem de referência Mycobacterium tuberculosis H37rv, como controle positivo da genotipagem. O DNA foi extraído das amostras através da aplicação de choque térmico. A amplificação dos espaçadores foi realizada através dos primers Dra (marcado com biotina) e DRb, que possibilitam a amplificação das regiões de “Direct Repeat” unicamente presentes no genoma das bactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis. A hibridização dos produtos da PCR se deu pela imobilização dos mesmos em membrana previamente sensibilizada com as seqüências dos 43 tipos de oligonucleotídios espaçadores conhecidos. Este procedimento foi realizado em miniblotter M45 Isogen, levado ao forno de hibridização a 60°C durante 1h sem agitação. Após esse período, as amostras foram aspiradas do miniblotter, e a membrana foi retirada e resfriada. Após o resfriamento foi adicionado o conjugado estreptavidina-peroxidase, e a membrana foi então incubada a 42°C por 1h. Para a detecção da quimioluminescênia, a membrana foi incubada por mais 10min com 20ml de ECL (líquido de detecção). A membrana foi então coberta com um plástico transparente e exposta a um filme radiográfico por 2h.

Das 1428 amostras de escarro analisadas, 740 foram tratadas e semeadas em meio de cultura Louwestein Jensen obtendo-se , até o momento, os seguintes resultados conclusivos: 5% foram positivas em cultura e baciloscopia. Já 74% apresentaram resultados negativos em ambos os procedimentos. 2% exibiram baciloscopia positiva e cultura negativa. Outros 7 % exibiram resposta negativa à baciloscopia, porém positiva na cultura. Foi realizado spoligotyping de 26 amostras que apresentaram cultura positiva. Como pôde ser verificado, as linhagens circulantes em sua maioria (46%), foram de tipos e famílias considerados novos por não terem seus perfis encontrados em nenhum banco de dados disponível. Puderam ser classificadas como pertencentes à família LAM (Latin America and Mediteraneum) apenas 31%. Esse dado, embora ainda não representativo devido ao tamanho da amostra e do curto período estudado, pode ser considerado um indicativo do que pode ser recuperado com o andamento do projeto. No entanto, estaria em desacordo com os dados disponíveis em levantamentos realizados em outros países da América Latina e Europa (referência) e mesmo com os dados obtidos no período de agosto de 2003 a julho de 2004 pelo mesmo grupo de pesquisa do LMA UFS (dados não publicados), que detectou uma maioria de tipos pertencentes a família LAM (70,5%), embora já sinalizasse com a perspectiva de tipos e famílias novos. Outro dado que pode vir a ser interessante quando do aumento da amostragem foi a possível presença de famílias Haarlen e Haarlen 3 (0,8 %) consideradas raras.

Várias informações podem ainda ser reveladas quando da associação entre tipagem e dados clínicos: o índice de reinfecção endógena ou exógena, detecção de infecção mista, infecção por M bovis, perfil de resistência às drogas, que pode auxiliar nos casos em que a bactéria adquiriu resistência durante ou após a terapia e, cujo paciente, foi reinfectado com uma linhagem diferente. Além das possibilidades citadas, pode-se ter a detecção confiável de contaminação cruzada no laboratório. Portanto, a genotipagem das linhagens de M. tuberculosis isoladas de pacientes com tuberculose é um dado muito utilizado em várias situações. Dados disponíveis na Rede Brasil de Tuberculose informam que cerca de 3% de pacientes dos quais foram isolados M. tuberculosis não têm TB. Além disso, quando os achados clínicos não sugerem TB, a genotipagem dos isolados pode indicar a ocorrência de contaminação cruzada, o que leva à interrupção do tratamento com drogas antituberculosas. A tipagem por Spoligotyping mostrou-se eficiente na diferenciação dos tipos moleculares de Mycobacterium tuberculosis circulantes no Estado de Sergipe. A maioria das linhagens de M.tuberculosis analisadas no presente estudo pertencem a tipos e/ou famílias ainda não descritos, podendo, portanto, serem consideradas novas. Dentre as linhagens de M. tuberculosis da família LAM que circularam e/ou circulam no Estado de Sergipe, a maior parte pertence à família LAM 6 de tipo 64.