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E. Ciências Agrárias - 7. Ciência e Tecnologia de Alimentos - 4. Ciência e Tecnologia de Alimentos
AVALIAÇÃO DO PROTOCOLO DE ISOLAMENTO DO DNA EM ALIMENTOS DERIVADOS DE MILHO PARA ANÁLISE DE OGM
Andréia Zilio Dinon 1
Caroline Tagliari 1
Ana Carolina Maisonnave Arisi 1
(1. Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos/CAL)
INTRODUÇÃO:

Organismos Geneticamente Modificados (OGMs) são produzidos a partir da técnica do DNA recombinante que consiste na inserção, no genoma da planta, de um ou mais genes de forma a garantir a expressão das características de interesse. A produção mundial de grãos geneticamente modificados (GM) ou transgênicos está em expansão. O milho GM resistente a insetos parasitas deste vegetal e tolerante ao herbicida glufosinato de amônio é uma das principais espécies transgênicas mundialmente cultivada. Atualmente, a produção e a comercialização de milho GM é proibida no Brasil. O comércio de grãos GM e seus derivados é regulamentado ao redor do mundo. A legislação brasileira, Decreto 4680, obriga a rotulagem de produtos ou alimentos que contenham ou sejam derivados de OGM acima do limite de 1% do produto. O aumento na demanda por análises da presença de resíduos transgênicos em matérias-primas e em alimentos processados exige o isolamento de DNA amplificável. Os métodos baseados na detecção de DNA, através da reação em cadeia da polimerase (PCR), são eficientes até mesmo para amostras altamente processadas, quando o DNA está fragmentado, como geralmente ocorre nos alimentos industrializados. O objetivo deste trabalho é proceder à extração do DNA e a detecção do DNA amplificável do milho em alimentos (farinha, fubá e polenta) através da análise qualitativa baseada em PCR, como passo primordial para detecção de OGM.

METODOLOGIA:

O DNA foi extraído pelo método CTAB de 27 diferentes produtos comerciais derivados do milho (7 farinhas de milho, 8 fubás, 8 polentas e 4 bijús) além de 2 amostras de grão de milho crioulo e de 2 amostras de extrato de soja utilizadas como controle. Utilizou-se 100 mg de cada amostra, tampão CTAB, proteinase K, RNAse, clorofórmio, isopropanol, etanol e tampão TE no procedimento de extração do DNA. A leitura da densidade ótica (D.O.) do DNA purificado em TE foi realizada em espectrofotômetro Hitachi U-1800® nos comprimentos de onda de 260 e 280nm, a fim de medir o rendimento e a pureza do DNA extraído. A eletroforese em gel de agarose 0,8%, a 400mA e 80V, por 30 minutos, foi realizada para verificar a integridade do DNA genômico. O volume final da PCR foi de 25ml, contendo tampão para PCR 1X (Invitrogen), 2,5mM de cloreto de magnésio, 50ng de DNA, 1,0mM de cada iniciador, 0,2mM de cada dNTP, 1U de Taq Polimerase. Após 10 min à 95°C para desnaturação, a amplificação foi realizada durante 50 ciclos (30s a 95°C, 30s a 64°C, 30s a 72°C) e 7 min à 72°C para extensão final. Utilizou-se o par de iniciadores IVR1-F / IVR1-R para amplificar um fragmento de 226 pb específico para o gene da invertase do milho. Os produtos de amplificação foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,5%, a 400mA e 80V, por 50 minutos, usando marcador de peso molecular 50 pb a fim de comprovar a presença de DNA do milho amplificável nas amostras extraídas.

RESULTADOS:

O método CTAB foi eficiente para extração do DNA amplificável para todas as amostras. A eletroforese do DNA genômico comprovou a integridade do DNA extraído para as diferentes amostras. A eletroforese do DNA amplificado por PCR permitiu observar o fragmento de 226 pb da invertase do milho e confirmou a qualidade do DNA extraído para todas as amostras. Uma amostra de farinha de milho e três amostras de fubá apresentaram amplicon com intensidade mais forte enquanto uma amostra de grão e três de farinha de milho apresentaram amplicon com intensidade mais fraca para este fragmento, as demais amostras apresentaram amplicons com intensidade moderada. Provavelmente este fato ocorreu devido à presença de inibidores da amplificação por PCR que podem estar presentes em maior quantidade nas amostras que revelaram amplicons mais fracos e em menor quantidade nas outras amostras. Desta forma, as amostras que apresentaram amplicon com intensidade mais fraca serão novamente extraídas e analisadas por PCR utilizando-se um novo par de iniciadores (ZEO1/ZEO2) a fim de comprovar a qualidade do DNA extraído.

CONCLUSÕES:

O protocolo de isolamento de DNA através do método CTAB foi eficiente para extração de DNA amplificável para todas as amostras. A amplificação da invertase do milho permitiu confirmar a qualidade do DNA extraído para as amostras analisadas. As amostras que apresentaram amplicon com intensidade mais fraca poderão ser novamente extraídas e analisadas por PCR utilizando-se um novo par de iniciadores (ZEO1/ZEO2) a fim de atestar a qualidade do DNA extraído. Comprovou-se que o método CTAB de extração possibilitou a obtenção de DNA amplificável para diferentes amostras de milho o que permitirá seu uso em análises para detecção de OGM em alimentos derivados do milho.

Instituição de fomento: FAPESC/CAPES
 
Palavras-chave: isolamento do DNA; milho; OGM.
Anais da 58ª Reunião Anual da SBPC - Florianópolis, SC - Julho/2006