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C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 4. Metabolismo e Bioenergética

AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR E CAPTAÇÃO DE GLUTAMATO NO HIPOCAMPO DE RATOS

 EM MODELO DE ISQUEMIA IN VITRO.

Scheyla Paula Bollmann Oleskovicz  1
Karina Brongholi  1
Wagner Carbolin Martins  1
Alcir Luiz Dafre  2
Carla Inês Tasca  1
(1. Departamento de Bioquímica / Centro de Ciências Biológicas / UFSC; 2. Departamento de Ciências Fisiológicas / Centro de Ciências Biológicas / UFSC)
INTRODUÇÃO:
A transmissão glutamatérgica está envolvida em diversas funções importantes do cérebro, no entanto, uma elevada concentração extracelular deste neurotransmissor faz com ele atue como uma potente neurotoxina. A superestimulação dos receptores de glutamato, seja por aumento da liberação ou pela diminuição da recaptação de glutamato, aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio, moléculas que podem danificar proteínas, DNA e lipídeos. Na isquemia, o estresse oxidativo tem sido implicado na fase aguda bem como na fase tardia da morte neuronal.  Estudos vêm demonstrando que os derivados da guanina (DG) modulam a transmissão glutamatérgica pela inibição da união de glutamato aos seus receptores, protegendo contra a neurotoxicidade mediada por receptores glutamatérgicos. Em modelos de privação de glicose e oxigênio (PGO) in vitro observou-se uma diminuição da viabilidade celular após 15 e 60 minutos de PGO seguida de reperfusão. Portanto o objetivo deste trabalho foi avaliar a captação de glutamato, a viabilidade celular em fatias de hipocampo submetidas à PGO e o papel dos DG como compostos neuroprotetores.
METODOLOGIA:

Ratos Wistar Machos (60 a 90 dias) foram mortos por decapitação e seus hipocampos foram rapidamente removidos para obtenção das fatias de 0,4mm utilizando-se o fatiador de tecidos de McIlwain. As fatias foram incubadas com tampão Krebs-Ringer (KRB), gaseificadas com carbogênio (95% de O2 e 5% de CO2), sendo mantidas a 37o por 30 minutos para a recuperação das mesmas. No modelo de PGO, as fatias foram incubadas com tampão isquêmico, onde a glicose foi substituída por 2-deoxi-glicose (um análogo não utilizável da glicose) e gaseificadas com nitrogênio, sendo mantidas por 15 ou 60 minutos nestas condições. No período de reperfusão de 2 horas, o tampão isquêmico foi substituído por KRB e gaseificadas com carbogênio. A adição dos DG ocorreu junto à PGO ou ao período de reperfusão. A viabilidade celular foi avaliada pelo método de redução do MTT (Azul de Tiazolil). Após o período de PGO e reperfusão, as fatias hipocampais foram incubadas com MTT à 37oC por 20 minutos. O formazam reduzido é solubilizado pela adição de dimetil-sulfóxido e a viabilidade celular é proporcional à leitura em 550 nm. Para a avaliação da captação de [3H]L-Glutamato, as fatias foram pré-incubadas por 15 minutos a 35°C, em solução salina balanceada de Hanks. A captação iniciou-se com a adição de 100 µM de L-[3H]Glutamato (0,33 µCi/ml), permanecendo por 7 minutos. A radioatividade foi avaliada em um contador para cintilação líquida e os resultados foram expressos em nmol de L-[3H]Glutamato por miligrama de proteína.

RESULTADOS:
Foi observada uma diminuição significativa na captação de glutamato no grupo submetido a 60 minutos de PGO seguido ou não de reperfusão. Quando adicionado 2 mM de Ditiotreitol (DTT), um agente capaz de reduzir grupos tióis do transportador de glutamato, houve um aumento significativo da captação de glutamato aos 60 minutos de PGO. A viabilidade celular diminuiu significativamente após 15 e 60 minutos de isquemia. Ao avaliarmos o papel neuroprotetor dos DG na PGO, observamos que o GMP promoveu parcial aumento na viabilidade celular após 15 minutos de PGO seguido de 2 horas de reperfusão. Entretanto, a Guanosina adicionada ao meio durante a reperfusão promoveu significativo aumento na viabilidade celular após 15 minutos de PGO seguido de 2 horas de reperfusão (101%).
CONCLUSÕES:

A diminuição da captação de glutamato pode contribuir para a redução da viabilidade celular observada no modelo de isquemia, devido ao aumento dos níveis de glutamato na fenda sináptica. A guanosina atuou como agente neuroprotetor revertendo a redução de viabilidade celular induzida pela PGO e reperfusão. A possível modulação do transporte de glutamato pela guanosina está sendo avaliada em nosso laboratório.

Instituição de fomento: CNPq, PROCAD/CAPES, FAPESC
 
Palavras-chave: privação de glicose e oxigênio; captação de glutamato; derivados da guanina.
Anais da 58ª Reunião Anual da SBPC - Florianópolis, SC - Julho/2006