| C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 6. Bioquímica |
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EXPRESSÃO DE UMA PERMEASE AGT1 MUTADA NO RESÍDUO ASP-123 EM Saccharomyces cerevisiae |
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| Débora Trichez 1 |
| Sérgio Luiz Alves-Junior 1 |
| Luiz Cláudio Miletti 1 |
| Boris Ugarte Stambuk 1 |
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| (1. Departamento de Bioquímica, CCB-UFSC, SC) |
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| INTRODUÇÃO: |
Em S. cerevisiae a permease AGT1 é responsável pelo transporte ativo, através do co-transporte H+-açúcar, de uma série de a-glicosídeos usados em diversas aplicações industriais das leveduras, como panificação, cervejaria, produção de bebidas destiladas e álcool combustível. Esta permease apresenta alta afinidade por sacarose e trealose, e baixa afinidade por maltose, maltotriose e α-metilglicosídeo. O transporte destes açúcares para dentro da célula é não só o primeiro passo do seu metabolismo, mas constitui também o fator limitante na fermentação do açúcar. Com o intuito de obter uma permease com propriedades cinéticas incrementadas torna-se necessário identificar quais aminoácidos estão envolvidos na ligação do próton e/ou na especificidade do substrato durante o transporte. Estudos com o transportador de lactose de E. coli codificado pelo gene LacY (um co-transportador lactose-H+), têm revelado que a ligação e translocação do próton é mediada por apenas 4 resíduos (Glu-126, Arg-144, Glu-269, e His-322) dos mais de 10 aminoácidos carregados presentes nas hélices transmembrana da permease. Analisando a estrutura prevista do transportador AGT1 identificamos apenas 4 aminoácidos carregados em seus segmentos transmembranas (Glu-120, Asp-123, Glu-167 e Arg-504), resíduos que estão significativamente conservados nas mesmas posições em vários outros genes de transportadores de a-glicosídeos em Saccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, e Candida. |
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| METODOLOGIA: |
Para iniciar uma análise estrutural da permease AGT1, utilizamos mutagênese sítio-dirigida para substituir estes resíduos de aminoácidos usando PCR e um plasmídeo que permite a sobre-expressão do gene AGT1. Os mutantes obtidos foram confirmados através de sequenciamento, tomando a precaução de que nenhum outro resíduo de aminoácido tenha sido mutado no transportador. A funcionalidade das permeases mutantes foi testada através de transformação e ensaios de fermentação e crescimento em meio mínimo contendo maltotriose sem uracila (que permite a seleção dos transformantes) por uma cepa de S. cerevisiae deletada no transportador (agt1∆), e comparada com a mesma cepa transformada com o plasmídeo carregando a permease normal. Amostras foram colhidas durante o crescimento em glicose, maltose ou maltotriose, e os sobrenadantes foram utilizados na determinação de etanol e consumo de glicose e α-glicosídeos. A produção de etanol pela cepa foi dosada através da reação com as enzimas álcool oxidase e peroxidase; o consumo de maltose e maltotriose foi determinado colorimetricamente através da reação com metilamina em pH alcalino; e o consumo de glicose foi determinado utilizando um kit enzimático comercial. |
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| RESULTADOS: |
A primeira permease mutante obtida possui a substituição do resíduo de aminoácido Asp-123, localizado no primeiro segmento transmembrana do AGT1, pelo resíduo de aminoácido neutro glicina. Os resultados obtidos mostram que a cepa de levedura carregando esta permease mutada fermentou e cresceu normalmente nos meios controles contendo glicose e maltose. Entretanto, apesar da permease mutante apresentar o mesmo padrão de crescimento em maltotriose que a cepa com o AGT1 normal, a fermentação do açúcar foi significativamente mais baixa e o consumo de maltotriose mais lento do que a levedura portando o transportador não mutado. A análise do co-transporte H+-açúcar com vários a-glicosídeos transportados pelo AGT1 indicou também uma significativa diminuição do transporte ativo dos açúcares. |
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| CONCLUSÕES: |
Estes dados sugerem que Asp-123 está provavelmente envolvido no co-transporte açúcar-H+. Porém, novas análises ainda serão realizadas para verificar o envolvimento dos outros 3 resíduos de aminoácidos carregados no transporte ativo de açúcares mediado pela permease AGT1. Apesar da importância das proteínas transportadoras de açúcares na levedura S. cerevisiae, pouco se conhece sobre suas estruturas. Portanto, uma melhor compreensão do transporte ativo de α‑glicosídeos, fornecendo as bases moleculares do processo, é de extrema relevância para o desenvolvimento de estratégias que permitam a otimização dos processos fermentativos industriais. |
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Instituição de fomento: FAPESP (04/10067-6) e CNPq (478126/03-4 & 507123/04-2)
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Palavras-chave: AGT1; permease; Saccharomyces. |
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| Anais da 58ª Reunião Anual da SBPC - Florianópolis, SC - Julho/2006 |
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