CONSIDERAÇÕES RELEVANTES SOBRE A BUSCA DA PADRONIZAÇÃO DE UM TESTE DE BIOTOXICIDADE CRÔNICA COM Vibrio fischeri E IMPLANTAÇÃO DE TESTE DE TOXICIDADE CRÔNICA COM Daphnia magna.

Testes de biotoxicidade são experimentos nos quais organismos vivos são colocados frente à substâncias  químicas e suas reações são observadas. Existem no mercado uma diversidade de ensaios com bioindicadores, sendo classificados em ensaios agudos e crônicos. Muitos organismos podem ser utilizados como bioindicadores. A escolha do bioindicador se refere a sua representatividade no sistema e sua aplicabilidade e facilidade de manipulação dos ensaios. A bactéria luminescente Vibrio fischeri e o microcrustáceo Daphnia magna são amplamente utilizados em ensaios de biotoxicidade aguda em todo mundo, sendo seu método padronizado e em alguns países o ensaio exigido por lei. No Estado de Santa Catarina esses ensaios são exigidos através da Portaria Estadual 017/02 FATMA. Ensaios de biotoxicidade aguda e crônica diferem pelo tempo de exposição do organismo a amostra, sendo que no agudo essa exposição é rápida e no crônico prolongada podendo abranger gerações como no caso das bactérias. Neste sentido, este trabalho teve por objetivo descrever o procedimento adotado na busca da padronização de um teste de toxicidade crônica com a bactéria luminescente Vibrio fischeri desenvolvido recentemente, comprovando sua sensibilidade perante substâncias referências e a implantação do ensaio de toxicidade crônica com o microscrutáceo Daphnia magna fazendo um comparativo entre os métodos no sentido de aplicabilidade.

Foram realizados ensaios de toxicidade utilizando a bactéria luminescente Vibrio fischeri, e também o microcrustáceo Daphnia magna. Os ensaios de toxicidade foram realizados no Laboratório de Biotoxicidade da empresa Umwelt Assessoria Ambiental. Para os procedimentos de ensaio com Vibrio fischeri teve-se a disposição o luminímetro Lumistox 200 (Dr. Lange GmbH), bem como termobloco, pipetas automáticas e demais equipamentos necessários ao ensaio.Para as análises de padronização optou-se por utilizar as substâncias de referência que são utilizadas para teste de viabilidade no ensaio agudo segundo norma ISO 11348. Utilizou-se o Cromo VI, na forma de Dicromato de Potássio e 3,5 Diclorofenol nos ensaios com Vibrio fischeri e Cromo VI nos ensaios com Daphnia magna. Para os ensaios com Daphnia magna, o laboratório conta com cultivo permanente deste bioindicador em condições controladas, com estufas, com e sem fotoperíodo, para cultivo e ensaios de toxicidade aguda. No ensaio de toxicidade crônica com Daphnia magna, o parâmetro observado corresponde à taxa reprodutiva das matrizes. Os procedimentos de cultivo e análise foram seguidos conforme norma  OECD TG 211(1998), ensaio de reprodução de Daphnia magna.

Os ensaios crônicos com a bactéria luminescente Vibrio fischeri apresentaram, dentro de uma única cinética, variações elevadas dos valores de inibição. Também foram observadas variações de valores entre as repetições paralelas, dentro da mesma série de diluição. As variações pareciam estar relacionadas a movimentação dos tubos do termobloco até o luminímetro no momento da medição. Houve necessidade de reformulação do meio de reconstituição. Ocorreu crescimento de biomassa bacteriana no sistema de ensaio, sendo comprovado realizando a comparação de biomassa inicial e final no ensaio. Levantou-se a hipótese deste crescimento estar influenciando na variação dos resultados de emissão de luz. No ensaio crônico com Daphnia magna em média para as diluições com a substância referência e controle, 90% dos indivíduos apresentavam-se prenhes no 5º dia, tendo seus primeiros filhotes no 6º dia. Houve diferença no número de filhotes entre as diluições dentre elas e o controle. Utilizando-se do método estatístico ANOVA  foi confirmado que houve uma diferença significante entre todas as amostras, com um F= 45.364 e P= 0,0000. O objetivo do ensaio foi verificar quais séries de diluições diferem perante o controle. Sendo que para isto utilizou-se o método estatístico de comparações múltiplas Bonferroni, onde este afirma que todas as amostras diferiram com significância do controle.

O principal ponto para a possível realização de um teste de toxicidade crônica é a reprodução do meio em que vive o ser para que o mesmo possa ser acompanhado no período do ensaio. Com a bactéria Vibrio fischeri este ponto em questão foi o desenvolvimento de um meio de cultura onde elas teriam condições de vida, no caso, o meio de reconstituição onde as bactérias são ativadas após congelamento e sobrevivem durante o período do ensaio. A maior dificuldade foi encontrar um meio onde não houvesse crescimento bacteriano exagerado, que comprometeria o ensaio como um todo. O meio formulado deverá ser testado com outras formas de ensaio sendo o método utilizado apresentou muitas variações nos valores de luminescência emitidos. Apesar disso o ensaio crônico com Vibrio fischeri se mostrou sensível perante determinadas substâncias, apesar do método utilizado não apresentar confiabilidade estatística. No ensaio de toxicidade crônica com Daphnia magna, o parâmetro observado corresponde à taxa reprodutiva das matrizes. Uma das principais condicionantes de aplicabilidade do ensaio é seu tempo de duração, que são 21 dias, e a necessidade de troca do meio a cada 3 dias, tendo a necessidade de mantê-lo com as mesmas características durante todo período de ensaio, tornando o ensaio trabalhoso e oneroso caso aplicado comercialmente.