| C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 3. Enzimologia |
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INIBIDORES DA COLAGENASE DO Clostridium histolyticum |
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| Sergio Roberto de Andrade Leite 1 |
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| (1. Instituto de Química, Campus de Araraquara / UNESP) |
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| INTRODUÇÃO: |
A gangrena gasosa é um processo infeccioso grave e de evolução rápida, que pode ocorrer a partir da contaminação de ferimentos por bactérias do gênero Clostridium, a saber: C. perfringens, C. histolyticum, C. septicum, C. sporogenes e o C. bifermentans, entre outras. Estes organismos, sob condições apropriadas, (baixa tensão parcial de oxigênio), multiplicam-se rapidamente e produzem uma série de toxinas e de enzimas hidrolíticas, responsáveis pela patogenia e manifestações clínicas do processo. Estas se caracterizam por necrose extensa do tecido muscular e conjuntivo a partir do ferimento contaminado original, mais manifestações sistêmicas. A causa primária da necrose é a lise das estruturas teciduais pelas enzimas líticas, v.g., lecitinase, hialuronidase, desoxi-ribonuclease, proteases diversas, como a gelatinase e a colagenase, com destaque para esta última, como uma das principais responsáveis pela destruição do tecido conjuntivo, muscular e vascular. No trabalho presente nos propomos a estudar inibidores da colagenase do C. histolyticum. Primeiro, trata-se de um modelo conveniente para a padronização de métodos de estudo de inibidores de colagenases, uma vez que esta enzima é facilmente obtida comercialmente. Segundo, qualquer informação a respeito de possíveis inibidores desta enzima poderá ser útil ao desenvolvimento de fármacos auxiliares no tratamento da gangrena gasosa. |
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| METODOLOGIA: |
O trabalho consistiu em uma parte experimental, na qual se verificou o efeito de diferentes substâncias sobre a colagenase do C. histolyticum, e de uma parte teórica, na qual se fez a simulação das estruturas destas substâncias e da sua interação com a referida colagenase. A medida da atividade da colagenase foi feita por reação entre tal enzima e colágeno de tendão bovino, em meio tamponado em pH 7,5 e a 37°C, por 5 horas. A extensão da hidrólise era avaliada pela dosagem dos aminoácidos resultantes por reação com ninhidrina e leitura da absorbância em 600nm. Foi testada a atividade de diferentes ligantes, a saber: oxicans (meloxicam, tenoxicam e piroxicam), tetraciclinas (tetraciclina, doxiciclina) e alendronato de sódio, através da determinação do IC50 e, quando observada atividade inibidora, da medida da constante de inibição, Ki. A parte computacional consistiu na determinação da estrutura tridimensional dos ligantes, mediante cálculos de minimização de energia, por métodos de Mecânica Molecular Clássica e de Mecânica Quântica. Em seguida foi feita a simulação da interação dos ligantes com o centro ativo da colagenase, este obtido da estrutura da enzima determinada por difração de Raios-X (Protein Data Bank estrutura 1NQD). Esta simulação consistiu em cálculos de ajuste (“docking” em inglês) e na determinação da energia de ligação enzima-ligante. |
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| RESULTADOS: |
Dos ligantes testados, o único que apresentou efeito inibidor sobre a colagenase do C. histolyticum foi o piroxicam (Ki = 1,42 mM). Curiosamente, o alendronato teve efeito ativador sobre a enzima. Tais resultados foram interpretados à luz das simulações computacionais realizadas. |
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| CONCLUSÕES: |
Os cálculos de ajuste ligante-enzima e a consecutiva determinação da energia de ligação permitiram avaliar as interações entre os ligantes e os resíduos de aminoácidos do centro ativo da enzima, por ligações de hidrogênio, bem como a força de tais ligações. É conhecida da literatura a importância de cada um desses resíduos na atividade enzimática, através da sua substituição por outros resíduos. A substituição da maioria deles diminui a atividade. Faz exceção o Arg 929, cujo efeito é oposto, aumentando a atividade. Foi possível associar a interação mais intensa com grupos relevantes à atividade com o efeito inibidor do piroxicam e a interação mais forte com o grupo Arg 929 à ativação causada pelo alendronato. Concluindo, a simulação computacional realizada, por auxiliar no entendimento da relação entre o efeito inibidor de um ligante e sua interação com grupos do centro ativo da enzima fornece subsídios ao planejamento de modificações estruturais daquele, as quais possam favorecer tais interações e, conseqüentemente, intensificar seu efeito inibidor sobre a atividade enzimática. |
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Instituição de fomento: FAPESP
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Palavras-chave: colagenase; inibidores; Clostridium histolyticum. |
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| Anais da 58ª Reunião Anual da SBPC - Florianópolis, SC - Julho/2006 |
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