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C. Ciências Biológicas - 7. Fisiologia - 1. Fisiologia Celular e Molecular

Isolamento e Purificação de Protoplastos de Porta-Enxertos de Macieira

Luciana Rosa Leite  1
Monita Fiori de Abreu  2
Adriana C. M. Dantas  3
Miguel Pedro Guerra  4
(1. Acadêmica de Agronomia, UFSC, bolsista de IC-CNPq.; 2. Mestre em Recursos Genéticos Vegetais, UFSC.; 3. Bolsista PRODOC/CAPES, RGV, UFSC.; 4. Professor do Departamento de Fitotecnia e PPG/RGV da UFSC.)
INTRODUÇÃO:

A cultura de macieira é destaque no cenário frutícola nacional. Santa Catarina lidera o ranking de produção somando, na safra 2004/2005, mais de 500 mil toneladas (ICEPA,2005). Os altos índices de produtividade são reflexos da constante inovação tecnológica e atenção dispensada ao pomar pelos produtores. A produção de mudas de macieira tradicionalmente é efetuada por meio de técnicas de propagação vegetativa, com a enxertia de cultivares copa sobre porta-enxertos. A utilização de porta-enxertos eficientes tem sido cada vez mais importante para o sucesso da produção de maças. É essencial que o porta-enxerto seja compatível, induza precocidade e alta produtividade das copas. Deve apresentar também resistência a patógenos e boa adaptação aos locais de cultivo. Programas tradicionais de melhoramento genético têm mostrado poucos avanços, visto que a maioria das características de interesse agronômico é de controle poligênico. Para superar estas limitações, novas biotecnologias vêm sendo utilizadas. Uma delas é fusão de protoplastos que permite a formação de novos genótipos através da hibridação somática. Porém, para alcançar este objetivo, devem ser desenvolvidos protocolos eficientes de isolamento, purificação e cultivo dos protoplastos. Este trabalho buscou otimizar o protoloco de isolamento e purificação dos protoplasto de porta-enxertos de macieira M9 (Malus pumila Miller) e Marubakaido (Malus prunifolia Borkh).

METODOLOGIA:

Utilizou-se como fonte de protoplastos: mesofilo foliar de Marubakaido e M9, calos friáveis e suspensão celular de calos, de anteras de M9. Adicionou-se, sob as 500mg de cada explante, solução enzimática de Grosser & Chandler (1987) dissolvida em solução de manitol, CaCl2.H2O, NaH2PO4 e de MES e diluída em meio de cultivo. Depois de isolados, os protoplastos foram purificados por meio da filtragem da mistura enzimática contendo protoplastos. Logo em seguida o material filtrado foi para a centrífuga por 8 minutos a 800rpm. Ao pellet formado foi acrescido meio CPW 25M (Freason et al., 1973), sobre o qual foi adicionado delicadamente meio CPW 13M (Freason et al., 1973), formando um gradiente de densidade de sacarose-manitol. Em seguida, os tubos foram novamente centrifugados por 8 minutos a 600rpm. Os protoplastos purificados foram retirados da banda formada na interface entre os dois meios e diluídos em meio de cultivo. Os fatores avaliados foram a quantidade por grama de explante fresco e a viabilidade, através de técnica de coloração DAF, dos protoplastos recém isolados. Os experimentos testaram os meios de cultivo: BH3 0,6M, BH3 0,7M, BH3 0,8M (Grosser & Gmitter Jr., 1990) e KM (Kao & Michayluk, 1975) e o de tempo de digestão enzimática de: 4, 8, 12 e 16 horas. O delineamento experimental usado foi completamente casualizado, com fatorial 4x4, e 3 repetições. Os resultados foram submetidos à análise de variância e ao teste SNK (5%) de separação de médias.

RESULTADOS:

A análise dos dados para o rendimento de protoplastos não apresentou diferença estatística para todas as fontes de explante. O meio mais eficiente em todos os casos foi o KM, apresentando os resultados: 2,07x105 protoplastos por grama de mesofilo foliar de M9, 2,11x105 para mesofilo de Marubakaido, 3,34x105 para calos e 3,67 x105 para suspensão celular. Porém, no isolamento a partir de mesofilo foliar de Marubakaido o meio BH3 0,7M não foi diferente estatisticamente do KM, apresentando 1,98x105 protoplastos por grama de mesofilo. O mesmo ocorreu com o meio BH3 0,8M no isolamento com calos friáveis (3,17x105 protoplastos /grama de explante) e suspensão celular (3,57x105 protoplastos/grama de explante). Em relação ao tempo de digestão enzimática para mesofilo de M9 e Marubakaido, bem como para os calos friáveis os rendimentos já mencionados ocorreram com 8 horas de digestão. Já para a suspensão celular, este resultado foi alcançado em 4 horas. Quanto ao fator viabilidade dos protoplastos, foi mantido o mesmo padrão para todas as fontes. O meio que obteve maior porcentagem de protoplastos viáveis foi o KM em 8 horas de digestão celular. Foram obtidos cerca de 70% de protoplastos viáveis no isolamento por mesofilo de M9 e Marubakaido e cerca de 60% para as demais fontes.

CONCLUSÕES:

O processo de isolamento de protoplasto é um procedimento extremamente estressante para a célula vegetal, principalmente durante a digestão enzimática. O pré-tratamento dos explantes, enzimas de digestão, tempo de incubação em solução enzimática, volume do meio de incubação, velocidade de centrifugação no isolamento e purificação, genótipo, quantidade de explante e fonte de protoplastos (tecidos) devem ser detalhadamente estudadas para garantir bons níveis de viabilidade. Os resultados obtidos ao longo deste trabalho corroboram com o fato de que cada protocolo de isolamento de protoplastos deve ser determinado de forma empírica e específica para cada genótipo. Porém mostra que o meio KM é realmente promissor nos isolamentos de protoplastos de porta-enxertos de macieira, e o tempo máximo de incubação em solução enzimática deve ser de até 8 horas para estas fontes de explante, sendo que a partir de 12 horas de digestão, há uma redução drástica nos parâmetros avaliados.Todos os fatores aqui mencionados devem ser levados em consideração durante a realização de futuras pesquisas.

Instituição de fomento: CNPq/CAPES
Trabalho de Iniciação Científica  
Palavras-chave: hibridação somática; melhoramento; porta-enxertos.
Anais da 58ª Reunião Anual da SBPC - Florianópolis, SC - Julho/2006