| C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 3. Enzimologia |
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ESTUDOS CINÉTICOS DE UMA β-N-acetilglucosaminidase parcialmente purificada e IMOBILIZADA EM SUPORTE FERROMAGNÉTICO, extraída do crustáceo Artemia franciscana |
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| Pablo de Castro Santos 1 |
| Luiz Roberto Diz de Abreu 1 |
| Ádila Lorena Morais Lima 1 |
| Robério Medeiros do Nascimento 1 |
| Ana Celly Bezerra Cruz 1 |
| Luciana Duarte Martins da Matta 1 |
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| (1. Departamento de Bioquímica, UFRN, Natal-RN) |
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| INTRODUÇÃO: |
Através de diversos estudos têm-se tentado identificar e caracterizar atividades glicosidásicas em organismos marinhos. A imobilização destas enzimas, que atuam sobre carboidratos, se presta à necessidade de caracterizar quimicamente estes compostos originados de diferentes fontes e, que apresentam funções diversas como resistência a infecção, controle de água e eletrólitos, cicatrização, adesão celular, divisão e crescimento celular, atividade anticoagulante, lubrificação das articulações, ou ainda, produzem oligossacarídeos modificados quimicamente com a intenção de estudar suas funções. Os Glicosaminoglicanos são compostos constituídos por hexosaminas (glucosamina ou galactosamina) e ácidos urônicos (glucurônicos ou idurônicos) onde geralmente apresenta sulfatação em suas estruturas. Em nosso trabalho, abordamos a caracterização cinética da β-N-acetilglucosaminidase imobilizada em Dacron Ferromagnético e sua ação sobre os glicosaminoglicanos. |
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| METODOLOGIA: |
Para a determinação do Km da enzima imobilizada (2mg de proteína) a mesma foi incubada com o p-nitrofenil-N-acetil-b-glucosaminídeo nas seguintes concentrações(0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9; 1,0; 3,0; 4,0; 6,0; 8,0 e 10,0 mM) durante 30 min a 45°C. Os ensaios foram interrompidos com 1mL de NaOH 0,25 N e o p-nitrofenol liberado foi lido em espectrofotômetro a 405 nm. Para a analise da influência do tempo sobre a atividade b-N-acetilglucosaminidásica, os ensaios ocorreram em diferentes tempos de incubação(5min; 10min; 15min; 30min; 60min; 90min; 150min; 210min; 300min e 360min) a 50°C. Após cada intervalo de tempo o p-nitrofenol liberado foi lido em espectrofotômetro a 405 nm. A influência da temperatura sobre a atividade enzimática foi medida através da incubação em diferentes temperaturas (5; 25; 37; 45; 50; 60; 70 e 80°C). Para a elucidação da estabilidade térmica, foram feitas pré-incubações da enzima imobilizada durante 1; 15; 20; 30; 60; 90; 120 e 240 minutos a 50°C na ausência do substrato. Após cada intervalo especificado foi adicionado p-nitrofenil-N-acetil-b-glucosaminídeo e os ensaios ocorreram a 45°C durante 30min. Com objetivo de analisar a influencia do pH sobre o p-nitrofenil-N-acetil-b-glucosaminídeo este foi preparado nos tampões cloreto de potássio 0,1 M pH 2,0; acetato de sódio 0,1 M pH 3,5; 4,5 e 5,5; fosfato de sódio 0,1 M pH 6,5 e tris HCl 0,1 M pH 7,5 e 8,5. e realizados a 50°C. |
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| RESULTADOS: |
As análises mostraram um Km aparente de 2,91 ± 0,48 mM. O efeito do tempo sobre a atividade da enzima mostrou que, após os trinta minutos iniciais de ensaio ocorreu diminuição na velocidade da reação. Já o efeito da temperatura sobre a atividade enzimática mostrou-se com maior atividade a 50°C, embora observa-se atividade significativa nas temperaturas de 45°C e 60°C. Para a estabilidade térmica podemos avaliar que após 15 minutos de pré-incubação, a eficiência na degradação do p-nitrofenil-N-acetil-b-glucosaminídeo pela enzima começa a ser prejudicada e ela perde 12% de sua atividade e no tempo de 240 minutos de pré-incubação, a atividade catalítica cai em 76%. O efeito do pH sobre a atividade da enzima imobilizada mostrou que a maior atividade ocorre no pH 5,5; embora a enzima ainda apresente em torno de 92% e 95% de atividade nos pH 6,5 e 7,5; respectivamente. Ação da b-N-acetilglucosaminidase imobilizada sobre substratos naturais apresentou melhor atividade sobre o heparam sulfato. |
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| CONCLUSÕES: |
Os resultados obtidos serviram para determinar o perfil cinético da enzima b-N-acetilglucosaminidase imobilizada em dacron ferromagnético, onde os valores obtidos foram: Km de 2,91 ± 0,48 mM, temperatura ótima a 50°C, o pH ótimo para a atuação da enzima imobilizada foi 5,5 e até o tempo de 30 minutos o complexo b-N-acetilglucosaminidase-Dacron ferromagnético teve a melhor velocidade inicial de reação. Foi caracterizado também seu efeito sobre os glicosaminoglicanos, onde a enzima mostrou-se capaz de degradar heparam sulfato. |
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Instituição de fomento: UFRN, CNPq-(PIBIC)
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Palavras-chave: Imobilização de enzimas; Glicosaminoglicanos; β-N-acetilglucosaminidase. |
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| Anais da 58ª Reunião Anual da SBPC - Florianópolis, SC - Julho/2006 |
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