| C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 2. Bioquímica dos Microorganismos |
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BIOSSÍNTESE DO TRIPTOFANO EM Chromobacterium violaceum: MODELAGEM ESTRUTURAL DAS SUBUNIDADES DA ENZIMA ANTRANILATO SINTASE |
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| Claudimir Antonio Carminatti 1 |
| Itamar Leite de Oliveira 1 |
| Gustavo Lopez Colpani 1 |
| Derce de Oliveira Souza Recouvreux 1 |
| Regina Vasconcellos Antônio 2 |
| Luismar Marques Porto 1 |
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| (1. Departamento de Engenharia Química e Engenharia de Alimentos/InteLAB/UFSC; 2. Departamento de Bioquímica/LBBMM/UFSC) |
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| INTRODUÇÃO: |
O triptofano é utilizado na síntese de proteínas e no crescimento celular. A via de biossíntese deste aminoácido aromático é de considerável importância devido à sua ausência em animais, existindo apenas em bactérias, fungos e plantas. Este fato a torna de especial interesse no desenvolvimento de herbicidas e antibióticos. A síntese do triptofano ocorre a partir de corismato, envolvendo cinco reações catalisadas por enzimas codificadas por um número variável de genes dependendo do microrganismo. A primeira etapa é a conversão do corismato em antranilato pela enzima antranilato sintase (AS). Em Chromobacterium violaceum o triptofano também é utilizado como precursor na formação de metabólitos secundários como a violaceína e outros compostos de interesse farmacológico. No genoma da C. violaceum ATCC12472, seqüenciado pela Rede Nacional do Projeto Genoma Brasileiro, os genes trpA-F e pabA-B foram anotados como codificadores das enzimas da via de biossíntese do triptofano. Ainda segundo a anotação, os produtos dos genes trpE, pabA e pabB são subunidades da enzima AS, enquanto a ORF CV0568 é uma provável AS. O objetivo deste trabalho foi analisar a enzima antranilato sintase da bactéria C. violaceum, comparando seus genes com as de alguns outros organismos procariotos, e modelar por homologia comparativa a estrutura terciária da proteína. |
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| METODOLOGIA: |
As seqüências dos genes que codificam as enzimas da via de biossíntese do triptofano foram localizadas e identificadas nos microrganismos estudados utilizando-se programas disponíveis publicamente na Web, a exemplo das plataformas de bioinformática do Brazilian Genome Virtual Institute of Genomic Research (BRGene) (www.brgene.lncc.br/), do National Center for Biotechnology Information (NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov) e do CvioCyc (http://cviocyc.intelab.ufsc.br). Com o objetivo de identificar as regiões conservadas entre os diversos microrganismos, as seqüências de aminoácidos das proteínas das bactérias selecionadas foram submetidas ao alinhamento múltiplo de seqüências utilizando o programa ClustalW (www.ebi.ac.uk/clustalw). Para a modelagem estrutural da enzima foi utilizado, além dos programas já citados, o banco de dados Swiss-Model (http://swissmodel.expasy.org). A seqüência molde obtida foi alinhada utilizando-se o ClustalW, que fornece dados de entrada do software MODELLER (www.salilab.org/modeller). O molde gerado para a proteína de interesse é visualizado com o software SPDBViewer (www.expasy.ch). Este modelo pode então ser avaliado através do critério de Ramachandran, o qual indica a qualidade estereoquímica da estrutura tridimensional obtida. |
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| RESULTADOS: |
As seqüências dos genes trpE, pabA, pabB e da ORF CV0568 da C. violaceum foram comparadas com as seqüências dos microrganismos Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Bacillus subtilis e Salmonella typhimurium. Os resultados do alinhamento sugerem que a enzima AS da C. violaceum é formada pelas subunidades trpE e pabA, pois ambas possuem os resíduos de aminoácidos pertencentes ao domínio catalítico em posições específicas relativas encontradas na AS das outras bactérias. O sítio alostérico foi identificado apenas na subunidade trpE, pois a mesma possui o consenso de ligação para a molécula do triptofano (LLESX10S e NPSPYMW). Além disso, a estrutura resultante da união das subunidades trpE e pabA possui uma massa molecular muito próxima à estrutura determinada experimentalmente encontrada na literatura. A ORF CV0568 não possui os resíduos que caracterizam os sítios específicos (alostérico e catalítico) da AS. A modelagem da estrutura tridimensional das enzimas trpE e pabA de C. violaceum utilizou como molde a proteína antranilato sintase (1I1Q:A e 1I1Q:B) de Salmonella typhimurium. Foram identificados os resíduos de aminoácidos relativos aos sítios catalítico e alostérico nas subunidades da AS de C. violaceum. A validação dos modelos realizada através do diagrama de Ramachandran apresentou, respectivamente, 99,3% e 98,1% dos resíduos de aminoácidos em regiões energeticamente favoráveis para a trpE e pabA. |
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| CONCLUSÕES: |
O conhecimento da estrutura da proteína antranilato sintase é de fundamental importância para o entendimento da biossíntese do triptofano, já que a união de duas moléculas deste aminoácido forma a violaceína, pigmento característico da C. violaceum que possui aplicações antibióticas e anti-tumorais. Pela comparação das seqüências dos genes, propõe-se que a enzima antranilato sintase da bactéria C. violaceum é formada pelas subunidades codificadas pelos genes trpE e pabA, cujo sítio catalítico está localizado nas subunidades trpE e pabA e o sítio alostérico apenas na subunidade trpE. A modelagem da estrutura terciária apresentou resultados com qualidades estereoquímicas superiores a 98% para ambas as subunidades, permitindo identificar as posições dos resíduos pertencentes ao sítio ativo e ao sítio alostérico. |
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Instituição de fomento: CNPq
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Palavras-chave: triptofano; antranilato sintase; Chromobacterium violaceum. |
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| Anais da 58ª Reunião Anual da SBPC - Florianópolis, SC - Julho/2006 |
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