| C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 2. Bioquímica dos Microorganismos |
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OBTENÇÃO DA ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DA ENZIMA ÁLCOOL DESIDROGENASE DE Clostridium acetobutylicum. |
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| Gustavo Lopes Colpani 1 |
| Daniela Muccillo 1 |
| Luismar Marques Porto 1 |
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| (1. Departamento de Engenharia Química e Engenharia de Alimentos/InteLAB/UFSC) |
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| INTRODUÇÃO: |
A produção biológica de hidrogênio é uma excelente alternativa de produção de energia. Os processos fermentativos são os mais vantajosos do ponto de vista industrial. Clostridium acetobutylicum é uma bactéria muito utilizada industrialmente e tem um metabolismo fermentativo complexo, que produz muitos metabólitos, incluindo hidrogênio, com bons rendimentos. Esses rendimentos podem ser melhorados com o uso de engenharia metabólica, por meio de um redirecionamento do fluxo de elétrons para a produção de hidrogênio. Um dos objetivos principais da engenharia metabólica é elucidar os parâmetros responsáveis pelo controle das velocidades. Um sério gargalo da modelagem metabólica tem sido a obtenção de parâmetros. Na ausência de dados para um certo organismo têm-se utilizado parâmetros estudados em outros organismos. Na C. acetobutylicum não foram encontrados dados cinéticos para a enzima álcool desidrogenase, responsável pela produção de etanol, sendo necessária a utilização de uma proteína homóloga, álcool desidrogenase de Lactococcus lactis, com os parâmetros já elucidados. Neste trabalho foram construídos os modelos tridimensionais dessa enzima para ambos os organismos. A metodologia utiliza-se de técnicas de modelagem por homologia, através de ferramentas de bioinformática. Os resultados obtidos pela modelagem estrutural foram comparados a fim de se avaliar a utilização de parâmetros e mecanismo cinético da L. lactis na modelagem metabólica da C. acetobutylicum. |
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| METODOLOGIA: |
A metodologia empregada neste trabalho é a comparação por homologia, uma hipótese de cunho evolutivo, na qual duas proteínas são homólogas caso derivem de um ancestral comum. A comparação entre estruturas terciárias de proteínas homólogas demonstra que estruturas tridimensionais são mais conservadas durante o processo evolutivo do que as estruturas primárias. Partindo-se desta hipótese, ferramentas de bioinformática são utilizadas para modelar a estrutura tridimensional da proteína de interesse. Este procedimento inicia-se com a identificação e seleção da proteína molde com maior homologia em relação às proteínas álcool desidrogenase de C. acetobutylicum e L. lactis, a partir de um banco de dados com seqüências de aminoácidos de diversas proteínas. Em seguida é feito o alinhamento entre as seqüências alvo e molde através de programas de alinhamento, sendo também predita a estrutura secundária de cada seqüência. A próxima etapa será, então, a modelagem da estrutura tridimensional da proteína de interesse utilizando-se o software Modeller, que necessita para sua execução do arquivo PDB da proteína molde, do arquivo com o alinhamento entre as seqüências, e do script de comando, como dados de entrada. O modelo gerado é analisado em relação à sua qualidade estereoquímica pelo software Procheck, que através de gráficos de Ramachandran examina os aminoácidos em relação às regiões energeticamente favoráveis. |
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| RESULTADOS: |
As proteínas álcool desidrogenase de C. acetobutylicum e L. lactis apresentaram uma identidade de 39,87% e 47,70%, respectivamente, com a proteína álcool desidrogenase de Bacillus stearothermophilus, que possui a estrutura cristalográfica definida. As seqüências foram então alinhadas e observou-se que o consenso padrão das álcool desidrogenases contendo zinco é conservado, sendo que os resíduos catalíticos da proteína molde alinham-se a idênticos aminoácidos da proteína estudada neste trabalho, sugerindo a hipótese de que a região na qual os aminoácidos da C. acetobutylicum estão localizados pode ser o sítio catalítico. Utilizando-se os dados de entrada, o modelo terciário da proteína alvo foi gerado, observando-se que seus possíveis aminoácidos catalíticos se sobrepõem aos da proteína de B. stearothermophilus. O enovelamento desta estrutura terciária foi então comparado com a predição da estrutura secundária constatando-se que esta possui a conformação terciária próxima à estrutura secundária predita, o que confirma a qualidade da modelagem. A validação do modelo proposto foi realizada utilizando o software Procheck, onde o gráfico de Ramachandran indicou uma boa qualidade, uma vez que mais de 99,7% dos resíduos de aminoácidos modelados encontram-se em regiões energeticamente favoráveis, ou seja, apresentam ângulos espacialmente possíveis. |
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| CONCLUSÕES: |
A modelagem da proteína álcool desidrogenase foi realizada pelo método de homologia e sua qualidade estereoquímica foi satisfatória. A maioria dos possíveis erros, inerentes a esta metodologia, foi descartada devido ao bom grau de identidade entre a estrutura alvo e molde. Devido às enzimas álcool desidrogenase das proteínas alvo possuírem homologia entre elas, e compartilharem uma seqüência homóloga em comum, pode-se assumir os dados cinéticos caracterizados para o organismo L. lactis na modelagem metabólica da C. acetobutylicum. Pela análise da estrutura, encontrou-se o possível sítio catalítico, devido à localização dos resíduos da proteína de C. acetobutylicum e da proteína molde estarem muito próximos quando as duas proteínas são sobrepostas. Porém, apesar da modelagem estrutural ter apresentado bons resultados, mutações sítio dirigidas e uma resolução estrutural por meios experimentais devem ser realizadas para a comprovação da conformação tridimensional aqui obtida que, sendo evidenciada, poderá agregar conhecimentos sobre o mecanismo enzimático. Além disso, devem-se realizar estudos que tragam informações dos parâmetros cinéticos na tentativa de otimizar a produção de hidrogênio e validar a metodologia aqui desenvolvida. |
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Instituição de fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
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Trabalho de Iniciação Científica
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Palavras-chave: Modelagem tridimensional; Clostridium acetobutylicum; álcool desidrogenase. |
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| Anais da 58ª Reunião Anual da SBPC - Florianópolis, SC - Julho/2006 |
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