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C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 1. Biologia Molecular
MODELAGEM in silico E ANÁLISE ESTRUTURAL DA ENZIMA PHA SINTASE (PhaC) DE Chromobacterium violaceum ATCC 12472
Cléo Rodrigo Bressan 1
Luismar Marques Porto 2
(1. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, CCB / UFSC; 2. Departamento de Eng. Química e Eng. de Alimentos, EQA, CTC / UFSC)
INTRODUÇÃO:
Os PHA´s (polihidroxialcanoatos) são poliésteres sintetizados por diversos microrganismos como substâncias de reserva energética. Os PHA’s possuem propriedades termoplásticas semelhantes às dos polímeros de origem petroquímica sendo, porém, biodegradáveis e biocompatíveis. Estes polímeros têm despertado grande interesse no meio científico e na indústria devido à sua ampla aplicabilidade, especialmente na área médica e farmacêutica. As PHA sintases (PhaC) são as enzimas responsáveis pelo processo de polimerização, a partir das unidades monoméricas, durante a biossíntese do polímero. Variações na especificidade e na atividade dessas enzimas são fatores muito importantes para a determinação da composição e da velocidade de biossíntese do PHA nas células. A estrutura terciária dessas enzimas ainda não foi elucidada, sendo os dados estruturais conhecidos até o momento derivados de análises e modelagens in silico. Visando a obtenção de informações que possam auxiliar na elucidação dos mecanismos envolvidos na definição da especificidade e atividade das PHA sintases foram obtidos modelos estruturais da PhaC de Chromobacterium violaceum através do método de modelagem por homologia. Este método fundamenta-se na hipótese de que seqüência de aminoácidos similar implica em estrutura e função similar. Assim, tendo a informação acerca da estrutura terciária de uma proteína, é possível predizer a estrutura terciária de outra proteína homóloga com estrutura desconhecida.
METODOLOGIA:
A seqüência da PHA sintase de C. violaceum foi obtida a partir do NCBI (gi:34498244). A busca por moldes foi feita usando-se duas abordagens distintas: buscas seqüência versus seqüência (PSI-BLASTp e SWISS-MODEL) e buscas seqüência versus estrutura (PHYRE, mGenTHREADER). Os alinhamentos das seqüências assim obtidas com a seqüência da PhaC de C. violaceum foram realizados utilizando o método de alinhamento seqüência versus estrutura (PHYRE). Os modelos estruturais foram gerados utilizando-se o software MODELLER 8.2.
RESULTADOS:
As buscas por moldes confirmaram, como previamente descrito, que as PhaC são membros da família das αβ-hidrolases, e apresentam um motivo característico de lipases (G-X-C/S-X-G), diferindo destas últimas pela presença de uma cisteína (C292 em C. violaceum) como base catalítica no lugar de uma serina. Ambas as abordagens utilizadas para a busca de moldes apontaram para as lipases gástricas canina e humana, 1k8q e 1hlg, respectivamente, como as estruturas mais adequadas para o processo de modelagem. Estas lipases apresentam elevado grau de identidade entre si; no entanto, a estrutura 1hlg representa a lipase em seu estado inativo (sítio catalítico bloqueado) enquanto que a 1k8q representa a sua forma ativa. Assim, optou-se pela obtenção de dois modelos: um obtido a partir da forma inativa da lipase (1hlg) e outro obtido a partir de sua forma ativa (1k8q). Devido à baixa identidade observada entre as seqüências da PHA sintase e das lipases, optou-se pelo método de alinhamento seqüência versus estrutura. Ambas as modelagens resultaram em estruturas satisfatórias, indicando que as PHA sintases podem possuir um mecanismo de bloqueio do sítio catalítico similar ao das lipases. A estrutura responsável por este mecanismo está constituída por α-hélices e está representada pelos resíduos 324 a 417 na PhaC de C. violaceum. Observou-se também a ocorrência no modelo de uma tríade catalítica orientada de modo muito similar ao observado em lipases (resíduos C292, D448 e H478).
CONCLUSÕES:
Apesar da baixa similaridade com os moldes, a utilização de algoritmos de alinhamento seqüência versus estrutura possibilitou a obtenção de modelos bastante informativos, permitindo identificar regiões da proteína que podem estar correlacionadas com a seletividade e atividade da PhaC. A presença da díade catalítica formada pelas bases C292 e H478 já havia sido relatada anteriormente em modelos previamente publicados, inclusive para a PhaC de C. violaceum; no entanto, a disposição do resíduo D448 de forma análoga à observada nas lipases ainda não havia sido reportada. Atualmente, o processo de biossíntese de PHA ainda não está completamente elucidado e o modelo mecanístico mais aceito propõe a participação de dois sítios catalíticos para a síntese de uma única cadeia polimérica, implicando, portanto, em uma estrutura dimérica com os sítios catalíticos dispostos próximos um ao outro. Apesar da relação evidente entre lipases e PHA sintases, os modelos obtidos a partir de lipases não são completamente satisfatórios, uma vez que nas lipases a base catalítica está situada no interior da proteína, não permitindo a disposição dos sítios conforme pressupõe o modelo mecanístico para síntese de PHA. Com base nestes resultados, outras abordagens para refinamento do modelo devem ser empregadas para uma descrição mais detalhada, especialmente da região compreendida entre os resíduos 324 e 417, os quais estariam relacionados ao controle da “exposição” ou “bloqueio” do sítio catalítico.
Instituição de fomento: CAPES
 
Palavras-chave: modelagem 3D de PHA sintase; análise estrutural de PhaC; Chromobacterium violaceum ATCC 12472.
Anais da 58ª Reunião Anual da SBPC - Florianópolis, SC - Julho/2006