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C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 3. Enzimologia
PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE UMA  β-GLUCURONIDASE EXTRAÍDA DO MOLUSCO Pomacea sp
Maria Lúcia Lira de Andrade 1
Juliana Maria Costa da Silva 1
Vanessa Duarte de Morais 1
Ana Celly Bezerra Cruz 1
João Felipe de Sousa Filho 1
(1. Departamento de Bioquímica -CB- UFRN)
INTRODUÇÃO:

Os glicosaminoglicanos sulfatados consistem em unidades repetidas de dissacarídeo com seqüências que variam na composição básica do açúcar, na ligação, na acetilação, e no grau de sulfatação.  Adicionalmente, seus comprimentos da cadeia podem variar de 1 a 25.000 unidades de dissacarídeo.  Podem ser solúveis, ancorados em superfície, ou vertente como ectodomínios solúveis. As classes de  glicosaminoglicanos inclui a heparina, que é produzido quase exclusivamente pelos mastócitos e é explorado terapeuticamente como um anticoagulante condroitim sulfato (CS) e o dermatam sulfato (DS), que, como heparam sulfato (HS), é encontrado na matriz extracelular, queratam sulfato (KS), o componente principal da córnea e da cartilagem, e ácido hialurônico (AH), a que é envolvida na lubrificação comum pela característica de habilidade de requisitar a água.    As enzimas eficientes para a síntese e a degradação de tais compostos são conseqüentemente importantes nos sistemas biológicos naturais e também como ferramentas para o conjunto e a desmontagem enzimática de tais glicoconjugados in vitro. Neste aspecto, uma compreensão das estruturas e as funções das β-glucuronidases (EC 3,2,1,31) são de importância considerável, para compreender melhor seu papel natural como um pré-requisito à engenharia de tais enzimas para modificar sua especificidade ou para convertê-los também em catalisadores sintéticos.

METODOLOGIA:

Para a obtenção do extrato protéico, os tecidos do molusco Pomacea sp foram homogeneizados em tampão acetato de sódio 0,1M pH 5,0 (v/v), em um processo de disrupção celular. Após a remoção dos restos celulares por centrifugação, o sobrenadante foi fracionado com sulfato de amônio em concentrações crescentes 0-50% e 50-80%. Logo após foram realizadas as centrifugações, os precipitados foram recolhidos, denominados F1 e F2 respectivamente e ressuspensos no mesmo tampão. Concentrações crescentes das frações foram incubadas com CS a 37ºC por 16 horas. As reações enzimáticas foram interrompidas e então submetidas a eletroforese em gel de agarose, sendo a partir de então visualizadas as atividades glicosidásicas. A fração F2 foi cromatografada em gel filtração Bio-Gel A 1,5m, eluída em tampão acetato de sódio 0,1M pH 5,0 em um fluxo de 1ml/3min. A atividade β-glucuronidásica das frações foi vista a partir da incubação com p-Nitrofenil-b-glucuronideo, as que apresentaram tal atividade isolada foram reunidas em um pool (F3), o qual foi realizado uma eletroforese SDS-PAGE, cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em fase reversa e alguns testes cinéticos, como influência do tempo, temperatura, concentração enzimática e pH na hidrólise do p-nitrofenil-β-glucuronídeo, bem como o efeito de diferentes compostos sobre a hidrólise de tal substrato. Também foi determinado o Km aparente e a Vmáx da β-glucuronidase.

RESULTADOS:

A fração F2 (50-80%) foi a que apresentou maior atividade glicosidásica sobre o CS comparada com a fração F1 (0-50%). A fração F2, foi então submetida a cromatografia em gel filtração, e apresentou em seu perfil, uma atividade β-glucuronidásica isolada entre as frações 25 - 29. Estas frações foram reunidas formando um “pool” (F3). A cromatografia liquida de alta eficiência apresentou apenas um pico majoritário e simétrico o que veio  ratificar o grau de purificação da β-glucuronidase, eluída em um gradiente de 95,4% de acetronitrila. A enzima foi purificada 6.362,5 vezes com o rendimento de 40,9%. Seu peso molecular é 100kDa determinado por SDS-PAGE. Foi visto alguns parâmetros cinéticos como a curva de tempo da atividade catalítica, que ocorre em sua  linearidade entre a segunda e a quinta hora. A concentração enzimática aumenta a atividade b-glucuronidásica, atingindo um platô a partir de 1,2 μg de proteína. Na análise do perfil da atividade com a variação de pH, observou-se um pH ótimo de 5,0. Com relação à curva de temperatura, nota-se uma termoestabilidade da enzima, onde a atividade máxima é vista na temperatura de 65ºC, decaindo a partir desta. Com relação aos efeitos de diferentes compostos sobre a β-glucuronidase, observou-se a estimulação da atividade pelo BaCl2, e os demais compostos inibiram sua atividade, com inibição pelos compostos: SDS, HgCl2, Na2PO4 e NaH2PO4. A β-glucuronidase possui um Km aparente de valor  72 x 10-2  mM.

CONCLUSÕES:

Foram identificadas atividades exo e endoglicosidásicas no extrato cru do molusco Pomacea sp, entretanto, foi purificada uma enzima com atividade específica para o p-nitrofenil-β-glucuronídeo. Esta enzima foi purificada 6.362,5 vezes, confirmada através de cromatografia líquida de alta eficiência, com um rendimento de 40,9%. A β-glucuronidase  apresentou massa molecular de 100 kDa, determinada por eletroforese em gel de poliacrilamida em SDS/PAGE. A determinação dos parâmetros cinéticos ideais para a catálise do p-nitrofenil-ß-glucuronídeo, apresentou atividade ótima em pH 5,0 e temperatura 65ºC por  4 horas. São necessárias para a degradação total de 3mM de p-N-β-glucoronídeo, a quantidade de 1,2mg de β-glucuronidase com um Km aparente de 72 x 10-2 mM. O BaCl2 aumentou a atividade da β-glucuronidase, e a atividade foi inibida completamente pelos compostos SDS e NaH2PO4

Instituição de fomento: CAPES e CNPQ
Trabalho de Iniciação Científica  
Palavras-chave: Glicosaminoglicanos; β-glucuronidase; Pomacea sp.
Anais da 58ª Reunião Anual da SBPC - Florianópolis, SC - Julho/2006