O Litopenaeus vannamei, também conhecido como ‘camarão branco’, é a espécie de camarão mais cultivada no Brasil. Este crustáceo não apresenta um sistema imune adaptativo, somente inato ou natural, sendo, portanto, incapaz de produzir anticorpos e células de memória, o que impossibilita o desenvolvimento de vacinas para prevenir infecções no cultivo. Nos camarões, o seu sistema imune está intimamente relacionado à hemolinfa, que se subdivide em uma fração líquida e uma fração celular, composta por hemócitos.

Os hemócitos podem se dividir em três subpopulações que se distinguem pela característica de grânulos citoplasmáticos: hemócitos hialinos, hemócitos semigranulares e hemócitos granulares. Contudo, apesar de haver essa classificação citológica, ela não é uniforme e universalmente aceita, devido a essas células serem muito instáveis in vitro, fazendo do seu estudo uma atividade árdua. Atualmente há muitos avanços tecnológicos que permitem estudos minuciosos, por exemplo, a produção de anticorpos monoclonais (AcMo). Essa técnica foi primeiramente descrita por Köhler e Milstein em 1975, e possibilitou a propagação de linfócitos B in vitro e a produção desses anticorpos específicos.

Portanto, este estudo visa à produção e caracterização de anticorpos monoclonais contra os hemócitos de L. vannamei, para auxiliar estudos da biologia celular dessas células, permitindo um maior entendimento dos mecanismos de defesa destes camarões tão importantes à carcinicultura brasileira.

A hemolinfa de L. vannamei foi retirada com anticoagulante da porção ventral do primeiro segmento abdominal, sendo que quando os hemócitos não eram utilizados imediatamente, eles foram fixados com 10% de paraformaldeído e estocados a 4ºC.

Para a fusão, cinco camundongos BALB/c foram imunizados quatro vezes com 2x10⁶ hemócitos fixados (uma imunização subcutânea e três intraperitoneais), com uma semana de intervalo entre as doses. Na 4^a imunização, uma sorotipagem foi feita por imunofluorescência indireta (IFI), fazendo um reforço endovenoso nos animais que apresentaram maior título. Após dois dias, os animais foram sacrificados, embebidos em álcool 70% e levados a um ambiente estéril. Esplenócitos do baço foram misturados às células de mieloma NS1 (proporção 7:1). A fusão entre células foi feita com polietilenoglicol 50% e, após lavagens, elas foram ressuspendidas em meio RPMI-1640, sendo que 2,5x10⁵ células foram colocadas em cada uma das 96 cavidades das placas de cultura. A seleção dos hibridomas foi feita utilizando meio HAT por 13 dias e meio HT por 4 dias. Quando os hibridomas ocuparam 2/3 da cavidade, o sobrenadante foi recolhido para detecção de anticorpos por IFI.

A sorotipagem realizada após a 4^a imunização fez-nos escolher dois camundongos para a fusão (títulos 1/80 e 1/160). Após a fusão conseguiu-se obter 6 placas de cultura de 96 cavidades.

Após 25 dias da fusão, apenas 9 poços apresentaram crescimento de 2/3 de hibridomas. Através de IFI, verificou-se que 4 poços eram positivos, sendo que apenas um poço se manteve estável.

Para se obter anticorpos monoclonais foram feitas duas diluições limitantes (DL). Na primeira, ocorreu crescimento até a diluição de 0,325 células por cavidade. Três poços foram escolhidos para serem propagados e utilizados, separadamente, para uma 2^aDL. Nessas placas ocorreu um crescimento rápido por toda placa, inclusive nas partes mais diluídas. Assim, coletou-se os sobrenadantes de 10 poços das placas da 2^aDL para fazer uma isotipagem dos anticorpos, verificando que todos apresentavam uma presença significante de IgG do tipo 1.

Para verificar onde e em que tipo de hemócito o AcMo produzido se liga, foi feita IFI em lâmina, com leitura em microscópio de luz confocal e de fluorescência. Verificou-se que o AcMo se liga a uma proteína citosólica não granular, presente, mas nem sempre, tanto em hemócitos hialinos como granulares, sendo que neste há uma forte fluorescência próxima à membrana.

Apesar de termos conseguido um número reduzido de poços com crescimento de hibridomas, houve a presença de um poço com células bastante estáveis, onde o sobrenadante se apresentou positivo contra hemócitos de L. vannamei. Após a clonagem dessas células, verificou-se que o AcMo se liga a uma proteína citosólica não granular bastante presente nos HG, podendo ser uma proteína vinculada ao sistema de defesa das células imunocompetentes do camarão, já que ela é provavelmente exocitada, devido à sua localização próxima à membrana.

Estudos ainda precisam ser feitos para assegurar a monoclonalidade. Técnicas como WB estão sendo padronizadas para avaliar a que proteína o anticorpo se liga e se esta está presente só nos hemócitos ou também na hemolinfa.

Assim, conclui-se que através da fusão de dois camundongos, obteve-se um AcMo específico a hemócitos do camarão mais cultivado do país, sendo que a proteína que ele se liga pode estar relacionada com os mecanismos de defesa desse crustáceo.