C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 1. Biologia Molecular |
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CLONAGEM DO GENE DE B-1,3-ENDOGLUCANASE DE Paracoccidioides brasiliensis |
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Christielly Rodrigues da Silva 1 |
Aline Helena da Silva Cruz 2 |
Célia Maria de Almeida Soares 3 |
Maristela Pereira 4 |
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(1. Departamento de Bíoquimica e Biologia Molecular/UFG; 2. Departamento de Bíoquimica e Biologia Molecular/UFG; 3. Departamento de Bíoquimica e Biologia Molecular/UFG; 4. Departamento de Bíoquimica e Biologia Molecular/UFG) |
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INTRODUÇÃO: |
Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico, causador da Paracoccidioidomicose (PCM). A PCM é uma micose sistêmica verificada na América Latina, desde o México até a Argentina; e atinge principalmente agricultores em idade produtiva e pacientes imunodeprimidos. Esta micose é contraída via trato respiratório através da inalação de micélio e/ou propágulos do fungo (que no ambiente sobrevive a 22° C), seguida de uma diferenciação para a forma de levedura nos alvéolos pulmonares (37° C). Em fungos, uma estrutura essencial que envolve processos celulares vitais como defesa, divisão celular e crescimento, é a parede celular. Em P. brasiliensis ela é constituída principalmente de quitina, glucanas, lipídios e proteínas, sendo que em leveduras, o principal polissacarídeo é a α-glucana, e em micélio, são a B-glucana e as galactomananas. Enzimas envolvidas no metabolismo da parede celular, como quitinases e glucanases, têm sido associadas a patogenicidade e virulência de fungos. Como o tratamento da PCM vem apresentando grandes limitações devido à alta toxicidade e pouca eficácia, especialmente em pacientes imunodeprimidos, antifúngicos específicos à parede celular, reduziria os problemas resultantes do tratamento. Portanto, o estudo da B-1,3-endoglucanase de P. brasiliensis representa um passo importante na busca de novos antifúngicos direcionados para moléculas ausentes em humanos. |
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METODOLOGIA: |
O microorganismo estudado foi a linhagem Pb01 (ATCC MYA 826) de P. brasiliensis, o qual foi mantido em meio Agar Saboraud dextrose por 7 dias a 36° C e por 15 dias a 22° C, para levedura e micélio, respectivamente. O cDNA parcial de B-1,3-endoglucanase foi identificado no transcriptoma de P. brasiliensis (http://www.biomol.unb.br), tendo sua seqüência sujeita a análises computacionais as quais sugerem que a enzima B-1,3-endoglucanase pertence a família 81 das glicosilhidrolases. Com isso, oligonucleotídeos foram construídos e o DNA parcial foi amplificado via Reação de Polimerase em Cadeia (PCR), usando a biblioteca de DNA de micélio para obter a sonda. A sonda, contendo 509 pares de bases, foi utilizada para a realização do rastreamento de B-1,3-endoglucanase na biblioteca genômica do organismo em estudo. O DNA total de P. brasiliensis foi extraído e utilizado na realização de “Southern blot” visando definir o número de genes de B-1,3-endoglucanase; além disso, “Northern blot” foi realizado com o RNA total extraído das formas leveduriforme e miceliana, objetivando comparar o nível de expressão desse gene nestas fases. |
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RESULTADOS: |
No rastreamento terciário da biblioteca genômica de P. brasiliensis foram obtidas 86 colônias positivas. Algumas foram avaliadas por “PCR” para a confirmação da presença do gene de B-1,3-endoglucanase. Dos clones que apresentaram a seqüência parcial do gene, dois foram selecionados para extração de DNA do fago. Tal DNA foi digerido com enzimas de restrição que liberaram o incerto na forma de um ou mais fragmentos. Com relação ao que foi observado no “Southern blot”, as análises indicam que o gene de B-1,3-endoglucanase não é de cópia única. Já para o “Northern blot”, os resultados comprovam que essa enzima é mais expressa em micélio do que em levedura. |
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CONCLUSÕES: |
Os resultados do rastreamento de clones no banco genômico podem levar ao isolamento de genes que não são os desejados. Assim, a digestão do DNA dos clones com enzimas de restrição e a PCR do DNA dos clones isolados da biblioteca genômica de P. brasiliensis, nos levam a crer que alguns clones não possuem o gene de uma B-1,3-endoglucanase. Por isso, a maioria dos clones selecionados não obteve os resultados esperados e, portanto, não foram utilizados para dar seqüência aos experimentos. Contudo, as análises de “Southern blot” sugerem a presença de genes homólogos ao da B-1,3-endoglucanase em P. brasiliensis. Enquanto que o “Northern blot” confirmou a presença de B-1,3-endoglucanase de P. brasiliensis tanto na forma de levedura quanto de micélio, evidenciando ainda a expressão diferencial do gene dessa enzima nas duas fases características de P. brasiliensis, sendo mais evidente na fase miceliana. |
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Instituição de fomento: CNPq; FUNAPE; IFS
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Trabalho de Iniciação Científica
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Palavras-chave: β-1,3-endoglucanase; Paracoccidioidomicose; Paracoccidioides brasiliensis. |
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Anais da 58ª Reunião Anual da SBPC - Florianópolis, SC - Julho/2006 |
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