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E. Ciências Agrárias - 5. Medicina Veterinária - 5. Reprodução Animal
VITRIFICAÇÃO DE FOLÍCULOS OVARIANOS PRÉ-ANTRAIS INCLUSOS EM TECIDO OVARIANO OVINO
Mônica Aline Parente Melo 1, 2
Magda Marinho Braga 2
Juliana Jales de Hollanda Celestino 1
Ana Paula Ribeiro Rodrigues 1
José Ricardo de Figueiredo 1
Regiane Rodrigues dos Santos 1
(1. Laboratório de Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Pré-Antrais/LAMOFOPA; 2. Faculdade de Biologia - UECE)
INTRODUÇÃO:
A necessidade de desenvolver protocolos de preservação de ovários humanos tem levado a estudos em ovinos devido à similaridade do tecido ovariano de ambas as espécies, além de evitar problemas éticos. A criopreservação geralmente é realizada através do método de congelação lenta, utilizando crioprotetores penetrantes (dimetilsulfóxido – DMSO; e etilenoglicol - EG) adicionados ou não de crioprotetores não-penetrantes (sacarose). A congelação lenta consiste em um método de alto custo, pois necessita de equipamento sofisticado, e tal procedimento pode levar à formação de gelo intracelular, um dos fatores causadores da morte celular. A vitrificação, um método alternativo, consiste na congelação ultra-rápida (- 2500°C/min) na qual o material biológico passa diretamente para o estado vítreo sem exposição ao estado cristalino, evitando assim a formação de gelo intracelular. Para a congelação rápida, é necessário expor o tecido a altas concentrações de crioprotetores penetrantes (20 - 40%) e submergir o material biológico diretamente no nitrogênio líquido. Uma das técnicas consiste no método de vitrificação em superfície sólida, onde o ovário é congelado através de contato direto com uma superfície sólida resfriada a uma temperatura aproximada de – 150 a – 180 oC. Os objetivos do presente estudo foram avaliar o efeito do EG, DMSO e/ou sacarose sobre folículos pré-antrais ovinos, bem como o método de vitrificação em superfície sólida sobre a sua morfologia.
METODOLOGIA:
Ovários de 10 ovelhas sem raça definida foram coletados após o abate e transportados ao laboratório em PBS a 20 °C. Cada par ovariano foi dividido em 33 fragmentos de 1 mm3. Um fragmento (controle) foi imediatamente fixado em paraformaldeído 4%, enquanto os demais 32 fragmentos foram expostos e/ou vitrificados na presença de Meio Essencial Mínimo (MEM) adicionado de sacarose 0,5 M, DMSO 40% e/ou EG 40%. Cada fragmento foi inicialmente mantido em MEM à temperatura ambiente (~25°C) por 5 minutos e exposto à solução de vitrificação. Imediatamente após o período de equilíbrio, 16 fragmentos foram submetidos à remoção do crioprotetor e fixados para histologia clássica e os 16 fragmentos remanescentes foram colocados em uma superfície sólida parcialmente imersa em nitrogênio líquido. Para remoção do crioprotetor, foram preparadas as soluções de diluição (SD). SD-I continha MEM com ou sem sacarose 0.3 M; SD-II continha MEM com ou sem sacarose 0,15 M; SD-III consistia de MEM. Os fragmentos vitrificados foram colocados em criotubos e estocados em um tanque de nitrogênio líquido. Para lavagem, os criotubos foram expostos à temperatura ambiente por um minuto e os fragmentos lavados a 37 °C por 5 minutos em cada solução e fixados para análise histológica. A média de folículos pré-antrais expostos, vitrificados e do controle foram comparadas entre si utilizando ANOVA one-way e teste Tukey.
RESULTADOS:
Um total de 3966 folículos pré-antrais foi analisado depois da exposição e vitrificação dos fragmentos ovarianos (aproximadamente 120 folículos por tratamento). As percentagens de folículos normais foram similares às observadas no controle (79,2%) quando os fragmentos ovarianos foram vitrificados em sacarose combinada com EG (74,0%) ou DMSO (76,2%), seguida da lavagem em MEM adicionado de sacarose. As percentagens de folículos normais após exposição ao crioprotetor não diferiram significativamente daquelas observadas após vitrificação utilizando EG (75,9%) ou DMSO (79,1%) adicionados de sacarose, o que mostra que a degeneração folicular foi causada pelo efeito tóxico dos crioprotetores e não pelo procedimento de vitrificação. Em contraste, a vitrificação de tecido ovariano ovino utilizando sacarose apenas como crioprotetor resultou numa redução significativa na percentagem de folículos normais (49.3%). Além disso, adição da sacarose no meio de lavagem melhorou significativamente a morfologia folicular em todos os tratamentos, exceto quando os fragmentos ovarianos foram vitrificados em meio contendo apenas DMSO 40%.
CONCLUSÕES:
Folículos pré-antrais ovinos podem ser vitrificados com sucesso quando utiliza-se EG 40% ou DMSO 40% em combinação com sacarose 0,5 M.
 
Palavras-chave: vitrificação; folículos pré-antrais ; ovinos.
Anais da 58ª Reunião Anual da SBPC - Florianópolis, SC - Julho/2006