As enzimas glicose-frutose oxidorredutase (GFOR) e gluconolactonase (GL) de Zymomonas mobilis, em reações consecutivas, agem catalisando a bioconversão de glicose e frutose em ácido glucônico e sorbitol, respectivamente. Do mesmo modo, Z. mobilis tem a capacidade de produzir outros ácidos orgânicos, a partir de misturas de frutose com diferentes aldoses alternativas à glicose. Dentre estes ácidos orgânicos, destaca-se o ácido lactobiônico, proveniente da oxidação de lactose, ocorrendo ainda a formação equimolar de sorbitol, produto de redução da frutose. O ácido glucônico e o sorbitol apresentam aplicações voltadas para a indústria de alimentos e farmacêutica. O ácido lactobiônico, por sua vez, tem alto valor agregado em razão das suas importantes aplicações na área médica e cosmética, sendo por isso o foco principal deste trabalho. Já foi descrito que a atividade catalítica de várias enzimas pode ser incrementada na presença de cátions metálicos; porém, não há relatos na literatura sobre a influência destes cátions sobre o complexo GFOR/GL. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo avaliar a ação de diferentes cátions metálicos sobre a atividade conjunta das enzimas GFOR/GL presentes no periplasma de Z. mobilis ATCC 29191 e sobre a produtividade do processo de bioprodução de sorbitol e ácido lactobiônico.

Z. mobilis foi cultivada em biorreator com 5,5L de volume útil, em meio contendo 150g/L de glicose, a 30ºC e pH 5,5. Após o cultivo, as células foram centrifugadas e permeabilizadas com brometo de cetil-trimetil-amônio (CTAB) para impedir o metabolismo fermentativo. Os ensaios de determinação da atividade de GFOR/GL na presença de diferentescátions, em concentrações de até 90 mM, foram conduzidos em reator, sob agitação magnética, contendo 100mL de solução 0,7M (glicose/frutose ou lactose/frutose) e 4g/L de células permeabilizadas, a 39ºC e pH 6,4. Uma unidade (U) de GFOR/GL foi definida como a quantidade de enzima que produz 1 mmol de ácido glucônico ou lactobiônico por hora. Os ensaios de bioconversão, visando comparar o processo na ausência ou presença de um cátion selecionado nos testes de atividade, foram realizados em reator, sob agitação magnética, com 240mL de solução 0,7M de frutose/lactose e 25 g/L de células, a 39ºC e pH controlado em 6,4 com NaOH 7M. As concentrações dos ácidos orgânicos foram estimadas em função do volume e da concentração da base utilizada durante a reação. Nos ensaios de bioconversão, os resultados foram comparados em termos da concentração final de ácido lactobiônico, da máxima velocidade específica de formação do produto (v_m em g ác. lactobiônico / g biomassa seca / h), medida nas primeiras horas de processo, e da produtividade.

Com glicose/frutose, substratos preferenciais de GFOR/GL, obtiveram-se respostas dependentes do cátion empregado e da sua concentração. Com 10mM, determinou-se aumento de atividade de 22, 33, 35 e 41%, com Mn⁺², Co⁺², Zn⁺² e Fe⁺², enquanto Fe⁺³, Al⁺³, Cu⁺² e Ag⁺ reduziram a atividade em 9, 13, 24 e 100%. Ca⁺², Mg⁺² e K⁺¹ não influenciaram a atividade. Com 50 mM de Mn⁺², Zn⁺², Co⁺² e Fe⁺², os incrementos de atividade medidos foram de 47, 65, 72 e 81%, enquanto que na presença de 90mM destes cátions, a atividade cresceu 62, 90, 124 e 100%, respectivamente. Para o par frutose/lactose, a adição de 10 e 50mM de Zn⁺² e Co²⁺ não melhorou a atividade, enquanto que com 90mM de Fe⁺² e Mn⁺², aumentos de atividade de 68 e 32%, respectivamente, foram medidos. Apesar dos melhores resultados com Fe²⁺ para frutose/lactose, a presença do cátion escureceu muito o meio, o que dificultaria a recuperação dos produtos. Assim, visando aumentar a velocidade do processo de bioprodução, avaliou-se a adição de 50, 90 e também 200mM de Mn⁺² ao meio, sendo que esta última concentração foi testada devido à maior massa de células/enzimas empregada na bioconversão. Na ausência do cátion, v_m atingiu 2,15mmol/L/h, sendo alcançada a concentração de 180g/L de produto, em 23,5h. Na presença de Mn⁺², em todas as concentrações testadas, atingiram-se valores de v_m entre 2,70 e 2,80mmol/L/h, com a concentração final superando 200g/L, em 23h, correspondendo a um aumento de cerca de 15% na produtividade do processo.

Os resultados confirmam o efeito positivo da adição de cátions metálicos sobre atividade catalítica de GFOR/GL na presença de glicose e lactose, sugerindo que estes atuem como co-fatores em pelo menos uma das enzimas do complexo enzimático. Por outro lado, a presença de cátions não mostrou, qualitativa e/ou quantitativamente, influência tão marcante sobre a bioprodução de ácido lactobiônico a partir de lactose, indicando que o efeito destes íons é dependente do substrato. Assim, são necessários novos estudos para identificar-se outros cátions que estimulem a atividade de GFOR/GL na presença de lactose, a fim de aumentar a velocidade global do processo e compensar, ao menos em parte, a baixa afinidade entre este carboidrato e o complexo enzimático. Adicionalmente, visto que os produtos de maior interesse para o processo, sorbitol e ácido lactobiônico, têm suas aplicações voltadas para as áreas da saúde e alimentos, é preciso que seja avaliada cuidadosamente a presença de resíduos metálicos nos produtos a fim de sejam evitadas concentrações nocivas dos cátions utilizados como co-fatores.