| C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 6. Bioquímica |
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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA E RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE 1H E 13C OFF-LINE - ANÁLISE DE CAROTENÓIDES EM SEMENTES DE VARIEDADES LOCAIS E COMERCIAIS DE Zea mays |
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| Shirley Kuhnen 1 |
| Priscilla Maria Menel Lemos 1 |
| Juliana Bernardi Ogliari 2 |
| Paulo Fernando Dias 3 |
| Antônio Gilberto Ferreira 4 |
| Marcelo Maraschin 5 |
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| (1. Doutoranda em Recursos Genéticos Vegetais, Depto. Fitotecnia, CCA, UFSC; 2. Laboratório de Pesquisas em Agrobiodiversidade, Depto. Fitotecnia, CCA, UFSC; 3. Laboratório de Bioatividade e Embriotoxicidade, Depto. BEG, CCB, UFSC; 4. Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear, Depto. Química, UFSCar; 5. Laboratório de Morfogênese e Bioquímica Vegetal, Depto. Fitotecnia, CCA, UFSC) |
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| INTRODUÇÃO: |
Os carotenóides são pigmentos amplamente distribuídos na natureza, que possuem como estrutura química básica um esqueleto tetraterpênico (40 átomos de carbono), sendo responsáveis pela coloração amarela, alaranjada e vermelha dos tecidos vegetais. De modo geral, estes pigmentos são classificados como carotenos e oxicarotenóides, também denominados de xantofilas. As xantofilas luteína e zeaxantina (compostos não pró-vitamina A) são os principais carotenóides encontrados em sementes de milho. Diversos estudos mostram que essas xantofilas desempenham funções biológicas importantes, tais como o bloqueio do crescimento de tumores, o aumento da função imune e a proteção contra a degeneração macular relacionada à idade. Devido ao crescente interesse na obtenção de xantofillas visando a sua utilização na produção de suplementos alimentares e/ou alimentos funcionais, a investigação desses compostos, particularmente em variedades cultivadas regionalmente (variedades locais), assume importância tanto para a indústria alimentícia e farmacêutica, como para o estímulo ao plantio desses cultivares, com a perspectiva de fomento a novos programas de melhoramento genético de Z. mays. Assim, o presente estudo teve como objetivo isolar, purificar e elucidar estruturalmente os carotenóides presentes na variedade local de milho MPA01, proveniente do município de Anchieta (SC), e na cultivar comercial BRS1030 (Embrapa). |
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| METODOLOGIA: |
Amostras trituradas (1g) de sementes das variedades MPA01 e BRS1030 foram tratadas com hexano:acetona (v/v) na presença de hidroxitolueno butilado (100 mg/L). O extrato organosolvente concentrado foi recuperado via filtração sob vácuo, ressuspenso em hexano (3 mL) e lavado com água destilada-deionizada (9 mL, 3x). Alíquotas (10 mL) das amostras foram analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em cromatógrafo Shimadzu LC-10A, equipado com coluna de fase reversa C18 (Vydac 218TP54, 25 cm x 4,6 mm Æ) e detector espectrofotométrico UV-visível (450hm) (MeOH:ACN, 90:10, fluxo: 1 ml/min). A identificação dos compostos baseou-se nos tempos de retenção de compostos padrões (Sigma-Aldrich) e sua quantificação utilizou uma curva de padrão externo. Posteriormente, efetuou-se a purificação dos compostos de interesse por cromatografia líquida em coluna (CLC). Para tal, carotenóides de sementes de milho (5g) foram extraídos e aplicados em coluna de alumina (18,3 ml) e eluidos sequencialmente com PE, PE:DE (1:1, v/v), DE e DE:EtOH (1:1, v/v). As frações coletadas para cada um dos solventes orgânicos foram reunidas, analisando-se a ocorrência dos compostos carotenoídicos via espectrofotometria UV-visível (Shimadzu 2301), através da leitura da absorbância em janela espectral de 350 a 750hm. Posteriormente, as frações organosolventes da CLC foram analisadas via CLAE e ressonância magnética nuclear unidimensional de hidrogênio (1H-RMN) e de carbono (13C-RMN). |
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| RESULTADOS: |
A CLAE demonstrou que as xantofilas zeaxantina e luteína são os carotenóides predominantes nas 2 variedades em estudo, além da presença de β-caroteno. Os teores de zeaxantina, luteína e β-caroteno foram, respectivamente 8,70; 4,0 e 0,06µg/g (MPA1) e 14,41; 1,61 e 0,06µg/g para a cultivar BRS1030. Os perfis espectrais das frações obtidas via CLC mostraram ser os carotenóides os pigmentos predominantes nestas, revelando valores máximos de absorção entre 410 e 480 hm. O perfil de eluição cromatográfica das frações demonstrou que o b-caroteno e outros carotenóides de mesma polaridade são eluídos preferencialmente com a utilização de PE:DE (1:1, v/v) e a análise cromatográfica desta fração revelou ser o b-caroteno o metabólito majoritário, representando ca. de 50% do conteúdo carotenoídico total. Dois compostos ainda não identificados no presente estudo, co-eluiram na fração DE, porém, a separação cromatográfica observada foi considerada insatisfatória. As xantofilas (zeaxantina e luteína) eluiram com a mistura de DE:EtOH (1:1, v/v). A purificação das xantofilas na cultivar BRS1030, via CLC, permitiu a obtenção de amostras de zeaxantina com grau de pureza de 93%, uma vez que tal variedade tem naquele pigmento sua xantofila majoritária: Para a variedade local, verificou-se um grau de pureza da mistura isomérica na ordem zeaxantina/luteína de 88%. Os resultados de 1H-RMN e de 13C-RMN confirmaram a estrutura do pigmento zeaxantina na fração DE:EtOH da variedade BRS1030. |
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| CONCLUSÕES: |
Os resultados cromatográficos relativos à análise qualitativa e quantitativa dos carotenóides nos extratos das amostras de milho em estudo sugeriram a necessidade de um refinamento do processo analítico, decorrente da complexidade química da matriz, principalmente pela possibilidade de formação de artefatos, e pela existência de estereoisômeros de alguns dos pigmentos em estudo. Nesse contexto, a estratégia de extração e de purificação dos carotenóides de milho usando CLC mostrou-se bastante eficiente para as xantofilas predominantes nas sementes daquele cereal. Além disso, as ferramentas de análise instrumental usadas no presente estudo (CLAE, UV-visível e 1H- e 13C-RMN) mostraram-se adequadas para monitorar os diferentes passos da purificação. O grau de pureza obtido para as xantofilas esteve correlacionado com a quantidade desses dois pigmentos na amostra. Isto porque, a separação de zeaxantina-luteína é mais eficiente com a utilização de uma coluna quiral, já que os mesmos são isômeros. Portanto, os resultados encontrados no presente estudo são considerados bastante satisfatórios e sugerem a possibilidade de uso de sementes de milho como alimento funcional e como fonte potencial para extração dos compostos de interesse. |
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Instituição de fomento: CAPES
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Palavras-chave: Zea mays; carotenóides; xantofilas. |
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| Anais da 58ª Reunião Anual da SBPC - Florianópolis, SC - Julho/2006 |
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