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C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 4. Genética Molecular

ANÁLISE DA GENOTOXICIDADE DO COMPLEXO trans-[Ru(II)Cl2(piridina-3-ácido carboxilico)4] E SUA INTERAÇÃO COM DNA PLASMIDIAL ''in vitro".

Willian Boneli de Almeida 1
Gerusa Maria Mezzari  1
Jean Borges Bertoldo 1
Marcos Marques Paula 1
Hernan Terenzi 2
Claus Tröger Pich 1, 2
(1. Universidade do Extremo Sul Catarinense - UNESC; 2. Universidade Federal de Santa Catarina -UFSC)
INTRODUÇÃO:

A química sintética de compostos com metais de transição, tem sido alvo de trabalho intenso por parte de vários grupos de pesquisa, com especial atenção ao seu potencial terapêutico e ação biológica. Complexos de Rutênio são de grande interesse, pois aliados aos métodos confiáveis de síntese e facilidade de controlar a afinidade dos ligantes apresentam, em muitos casos, entre suas características, atividade anti-tumoral, capacidade de interação com biomoléculas, potencial antioxidante, entre outras. O complexo trans-[Ru(II)Cl2(piridina-3-ácido carboxilico)4] foi descrito como agente antioxidante seqüestrando radicais hidroxil e inibindo a peroxidação lipídica. Também foi demonstrado sua interferência no metabolismo de NO e H2O2, apresentando atividade genotóxica em testes ''in vitro'' entre outras características. Levando em consideração estes resultados, este trabalho objetivou aumentar o conhecimento dos efeitos biológicos deste complexo através de teste de genotoxicidade ”in vivo” e “in vitro”, além de testes de sua interação com DNA plasmidial “in vitro”.

METODOLOGIA:

Após a aprovação pelo comitê de ética desta universidade a genotoxicidade do complexo foi analisada “in vitro” em concentrações de 8, 40, 200 e 1000µM utilizando leucócitos totais de 8 indivíduos saudáveis, não fumantes, que concordaram voluntariamente em participar incubados por 1:30h. Foram estabelecidas incubações com estas mesmas concentrações contendo 150µM de H2O2 para analise da interferência do complexo com esta substância. Os controles foram H2O2, água destilada e PBS. Para os testes “in vivo”, sangue periférico de 6 ratos wistar tratados via intraperitoneal com complexo (45,2; 90,2; 180,7 µM) e controles foi obtido a partir da cauda. Amostras foram plaqueadas sobre lâminas com agarose, submetidas à lise e eletroforese (25 V, 300mA) durante 15 min., coradas com nitrato de prata e analisadas em microscópio, observando tamanho e intensidade de cauda para 100 células de cada amostra. Na análise de interação do complexo e do ligante com DNA plasmidial, incubações de DNA com complexo nas concentrações de 50, 100, 250, 500, 1000 µM em pH 6,0, 6,5, 7,0 e 8,0 foram realizadas à 37ºC e 50ºC por 16h. A presença de atividade oxidativa foi analisada em incubações contendo 10% de DMSO. Estas incubações foram submetidas à corrida eletroforética em gel de agarose (100V a 30mA), coradas com brometo de etídio, fotografadas e analisado pelo software Scion Image®. A análise espectrofotométrica UV-vis da interação do complexo com H2O2 foi realizada utilizado razões de 1:0, 1:0,5, 1:1 1:2 e 1:4 respectivamente. O teste estatístico utilizado foi o ANOVA através do programa Biostatâ.

RESULTADOS:

Na análise de genotoxicidade “in vitro” foram encontrados resultados significativos (p<0,05) na concentração de 1000µM quando comparados com o controle negativo (água e PBS). Quando as células foram incubadas com complexo em presença de H2O2 uma atividade antimutagênica significativa (p<0,05) foi observada também na concentração de 1000µM comparando-se com o controle positivo (H2O2), Na análise “in vivo” de genotoxicidade diferenças significativas foram obtidas nas concentrações de 90,2µM/Kg (p<0,05) e 180,7µM/Kg (p<0,001). Nas análises de interação com DNA plasmidial, demonstrou-se que o complexo quebra o DNA superenovelado transformando-o em sua isoforma relaxada (circular aberto) em todas as situações, mas apresentando no entanto variações. A atividade aumenta progressivamente com a concentração e com a temperatura sendo ambos efeitos aditivos e diminui com o aumento de pH. O ligante não complexado não apresentou atividade em nenhuma situação. Nas testes de atividade oxidativa, ou seja incubações em presença e ausência de 10% de DMSO (quelante de radicais livres), a atividade sobre o DNA não apresentou diferenças significativas. A espectrofotometria em UV-vis demonstrou que o complexo incubado com concentrações crescentes de H2O2, teve diminuição significativa na sua banda de absorbância que varia de 350 à 500nm característica de sua forma reduzida (RuII) e um aumento da banda de absorbância em UV característica da forma oxidada (RuIII).

CONCLUSÕES:

O complexo apresentou efeitos genotóxicos “in vitro” em concentrações mais elevadas quando comparadas às que produziram dados significativamente diferentes “in vivo”. Desta forma pode-se inferir que um processo de ativação metabólica do complexo, semelhante ao proposto por Creczynski-Pasa (2001) para regulação de NO, está ocorrendo quando este se faz presente em organismos vivos. A atividade anti-genotóxica detectada na incubação em presença de H2O2, também em concentrações elevadas, tem como possibilidade a captura de radicais pelo complexo uma vez que a atividade reativa deste com o peróxido de hidrogênio é demonstrada na leitura espectrofotométrica. Outra possibilidade é que o metal, que é levado de sua forma reduzida (RuII) para sua forma oxidada (RuIII) na incubação com H2O2, tenha ação pró-oxidante e através de alta toxicidade elimine as células cujo DNA foi danificado, mascarando o resultado, suposição suportada pelo reduzido número de células presentes nas lâminas com resultados significativos. Em experimentos de interação com DNA plasmidial demonstrou-se a capacidade do complexo de quebrar DNA, dependente de concentração, de forma hidrolítica, pois ocorre em presença de DMSO. Esta também é mais pronunciada em pHs baixos levando a crer que a deprotonação do complexo, completa em pH 7, influencia na atividade do mesmo. Na incubação de DNA com ligante não complexado, os resultados obtidos foram nulos, demonstrando ser a atividade nucleásica característica do complexo.

Instituição de fomento: Universidade do Extremo Sul Catarinense-UNESC
Trabalho de Iniciação Científica  
Palavras-chave: Rutênio; DNA; Genotoxicidade.
Anais da 58ª Reunião Anual da SBPC - Florianópolis, SC - Julho/2006