59ª Reunião Anual da SBPC

INTRODUÇÃO:

O Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), micose sistêmica de natureza granulomatosa, que tem distribuição geográfica restrita aos países da América Latina. Sendo mais freqüente no Brasil. A PCM inicia-se primariamente nos pulmões, podendo se disseminar para outros órgãos. A transmissão, não é de contágio de indivíduo para indivíduo, sendo a infecção de natureza exógena,através da inalação de propágulos infectantes da fase miceliana, O P. brasiliensis é um fungo dimórfico, que se apresenta como leveduras multibrotantes quando cultivado a 37ºC ou no tecido do hospedeiro e como fungo filamentoso quando cultivado à temperatura ambiente. Cresce em diversos meios de cultura de forma lenta, desenvolvendo em torno de 15 a 30 dias, à temperatura ambiente, colônias geralmente brancas que ao estudo microscópico mostram um conjunto de hifas delgadas, ramificadas e septadas. Macroscopicamente, a 37 ºC a colônia tem aspecto cerebriforme de cor creme e ao microscópio observam-se células arredondadas ou ovais, com múltiplos brotamentos. Objetivando preparo e obtenção de exoantígeno do fungo termo-dimórfico Paracoccidioides brasiliensis e produção de soro hiperimune do referido fungo,para utilização em diagnóstico da PCM.

METODOLOGIA:

Os isolados fúngicos de Paracoccidioides brasiliensis envolvidos no estudo são Pb 113, Pb 30, Pb 15, Pb B-339, Pb 34, Pb 101,que pertencem a micoteca do Prof. Dr. Zoilo Pires da Camargo,e foram gentilmente cedidos para a realização do estudo.Os isolados de Paracoccidioides brasiliensis foram repicados em meio agar YPD e mantidos a 37ºC, com vários repiques sucessivos até a completa reversão para a fase leveduriforme.Após essa reversão pelo menos 10 tubos de cada isolado fúngico foram inoculados em 250ml de meio caldo YPD e incubadas 37°C sob agitação por dez dias,as culturas foram mortas,filtradas,dializadas e concentradas,constituindo o exoantigeno.Foi realizado o teste de imunodifusão para esses exoantigenos,somente os exoantigenos(pool) considerados adequados,foram utilizados na imunização de animais de experimentação para obtenção de soro hiperimune.As amostras de soro controle positivas produzidas em coelhos foram utilizadas nos ensaios sorológicos A determinação protéica dos exoantígenos foi realizada seguindo-se basicamente o método de Bradford, utilizando como padrão soro de albumina bovina (Sigma).Também foi realizada a analise eletroforética de cada lote produzido de exoantigeno,através do gel SDS-PAGE para verificar as proteínas excretadas pelos isolados fúngicos.

RESULTADOS:

A reversão completa de cada isolado se deu por volta de 7 dias. Ao microscópio, as leveduras se mostraram como estruturas globosas, de tamanho variado, por vezes multibrotante, identificando-se assim a levedura característica do fungo termo-dimórfico P. brasiliensis. Foram obtidos 53 lotes de exoantígenos com aproximadamente 15ml cada alíquota. Uma parte desta alíquota foi separada para a realização dos ensaios. Os exoantigenos produzidos a partir dos isolados fúngico foram testados por imunodifusão com soro controle sabidamente positivo (soro de paciente com PCM, título de 1:64) verificando que os exoantigenos dos isolados Pb 113, Pb 30, Pb 34, Pb 15 e Pb 101 forneceram reações positivas com presença de linhas de precipitação intensa e de fácil visualização.Em todos os lotes de exoantígeno produzidos foram realizadas a dosagem protéica e a variação na concentração protéica para cada isolado fúngico foi entre 3 a 315µg/ml.A análise da imunodifusão do soro hiperimune mostrou 2 linhas de precipitação com soro hiperimune não diluído (puro) e uma linha mais fraca na diluição de 1:2. O perfil protéico (antigênico) dos exoantígenos,apresentaram variação entre cada lote produzido podemos verificar a presença de proteínas com bandas pesando desde 15 kDa até acima de 220kDa.

CONCLUSÕES:

O diagnóstico da paracoccidioidomicose é feito pela visualização direta do agente em espécimes clínicos ou por meio do cultivo destes.Entretanto, o diagnóstico pode ser confirmado por métodos sorológicos,sendo útil em determinar a evolução da doença.O teste mais utilizado para o diagnóstico sorológico da paracoccidioidomicose é a imunodifusão.Verificou-se que o tempo de cultivo, tamanho do inoculo, tipo de cultura (estacionária ou em agitação) e o meio de cultura utilizado, são fatores que influenciam na qualidade das preparações antigênicas produzidas.Os isolados de P. brasiliensis secretaram em meio de cultura uma variedade de proteínas e estas diferem principalmente na quantidade de proteínas excretadas.Todos os exoantígenos reagiram positivamente no ensaio de imunodifusão indicando que estes podem ser usados como reagentes no diagnóstico da PCM.O pool de exoantígeno em gel de SDS-PAGE mostrou um perfil protéico bem variado de proteínas, e gp 43 esteve presente em quantidades expressivas.O pool de exoantígenos foi capaz de produzir em coelhos uma resposta adequada (1:2), mesmo quando comparadas com soro controle obtido clinicamente (1:64). O pool de exoantígeno e o soro hiperimune produzidos a partir deste, podem ser usados em ensaios sorológicos para o diagnóstico da PCM.

Instituição de fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico

Trabalho de Iniciação Científica

Palavras-chave: Exoantígeno, Soro hiperimune, P. brasiliensis

E-mail para contato: rosianepimentel@iec.pa.gov.br